综述：CRISPR工程化微生物组：活体治疗剂革新血癌免疫疗法

《npj Biofilms and Microbiomes》：CRISPR-engineered microbiome: living therapeutics revolutionize blood cancer immunotherapy

本综述系统阐述了CRISPR技术工程化肠道共生菌作为"活体治疗剂"在血癌免疫治疗中的前沿进展。文章聚焦三大核心主题：工程化菌株通过分泌免疫调节剂（如IL-15/IFN-γ）、靶向递送肿瘤裂解载荷（如CD19纳米抗体）和代谢工程（如丁酸盐生产）调控宿主免疫；关键使能技术包括CRISPR变异体（Base/Prime编辑）、噬菌体/LNP递送系统和生物防护策略；临床转化面临菌株稳定性、生物安全性和个体异质性等挑战，需结合多组学与AI模型实现精准医疗。

　　

CRISPR工程化微生物组：活体治疗剂如何重塑血癌治疗格局

在白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤等血液恶性肿瘤的治疗中，免疫逃逸、抗原异质性和治疗相关毒性仍是主要挑战。随着研究的深入，人类微生物组，特别是肠道微生物组，作为致癌作用、治疗疗效和毒性的关键调节因子崭露头角。肠道共生菌通过肠道-免疫轴影响全身免疫，其中微生物代谢物如短链脂肪酸（SCFAs）调节树突状细胞（DC）成熟、调节性T细胞（Treg）分化和髓源性抑制细胞活性。在血癌中，生态失调（以微生物多样性减少和Faecalibacterium或Akkermansia耗竭为特征）与疾病加速进展和CAR-T反应减弱相关。例如，富含Bifidobacterium的微生物组通过促进DC激活和CD8⁺T细胞浸润来增强PD-1阻断疗效，而Enterococcus优势与CAR-T输注后淋巴瘤患者发生严重细胞因子释放综合征（CRS）相关。相反，产丁酸盐的Clostridium butyricum通过抑制Wnt/β-catenin通路抑制肿瘤生长，这揭示了微生物组作为治疗靶点的潜力。

微生物组-血癌相互作用机制

微生物组对造血和免疫的影响是深远且多方面的。共生微生物群通过微生物相关分子模式（MAMPs）和代谢物关键调节造血干细胞和祖细胞（HSPC）分化。无菌小鼠模型显示HSPC群体显著减少和髓系分化受损，这种表型可通过重新引入细菌成分如脂多糖（LPS）或SCFAs逆转。SCFAs，特别是丁酸盐，通过组蛋白去乙酰化酶抑制调节造血前体细胞染色质可及性，使分化向髓系倾斜，并增强感染期间的应急造血。除了造血作用，肠道微生物通过影响T细胞极化直接塑造适应性免疫。Bacteroides fragilis衍生的多糖A通过Toll样受体2信号传导促进Treg分化，维持外周耐受，而分段丝状细菌（SFB）通过血清淀粉样蛋白A依赖性途径驱动T辅助17（Th17）细胞扩增。这种微生物群-免疫串扰延伸到免疫检查点调节，其中Akkermansia muciniphila通过增加DC产生IL-12上调CD8⁺T细胞上的PD-1表达，从而微调抗肿瘤反应。值得注意的是，微生物代谢物如吲哚-3-醛与肠道淋巴细胞中的芳烃受体结合，放大干扰素-γ（IFN-γ）产生和自然杀伤（NK）细胞对恶性细胞的细胞毒性。

生态失调在血癌发病机制中起着推动作用。与年龄相关的肠道屏障功能障碍允许革兰氏阴性菌及其代谢物（包括ADP-D-甘油-β-D-甘露庚糖（ADP-庚糖））全身易位，其通过ALPK1-NF-κB信号传导促进DNMT3A突变造血干细胞（HSCs）克隆扩增。这种代谢物-受体轴诱导转录重编程，赋予前白血病克隆竞争优势，将年龄相关生态失调直接与意义未明的克隆性造血（CHIP）演变联系起来。临床上，不同的微生物特征预测血液恶性肿瘤的结局。在急性髓系白血病（AML）中，Enterococcus主导的微生物组与化疗期间黏膜屏障损伤和菌血症增加相关，而Faecalibacterium富集的群落与缓解率提高相关，可能通过增强抗炎性IL-10产生。异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）患者中肠道α-多样性低表现出更高的移植物抗宿主病（GVHD）严重程度和死亡率，这是由Tregs重建缺陷介导的现象。关键的是，生态失调破坏了细胞免疫疗法；在CD19导向CAR-T输注前抗生素破坏微生物组的患者显示无进展生存期减少，原因是CAR-T扩增受损。来自应答者的粪便微生物群移植（FMT）通过重建Ruminococcus驱动的CAR-T细胞线粒体适应性恢复治疗效果，凸显微生物组作为治疗反应的可修改决定因素。

CRISPR工程化共生菌：从概念到现实

将CRISPR技术应用于微生物组工程需要一套强大的工具。CRISPR-Cas系统源自细菌适应性免疫，通过三个一般阶段（适应、表达和干扰）实现核酸序列的精确、可编程识别。最常用的工具包括：(i) 核酸酶活性Cas蛋白，如化脓链球菌Cas9和Cas12a，它们引入位点特异性双链断裂（DSBs），并通过宿主修复途径实现基因敲除或插入；(ii) 催化失活或切口酶Cas变体（dCas9/nCas9）与效应结构域融合，用于可编程转录抑制（CRISPRi）或激活（CRISPRa），而不产生DSBs；(iii) 精确编辑器，如碱基编辑器（BE）和引物编辑器（PE），可在不产生DSBs的情况下实现单核苷酸改变或小片段插入。递送格式如质粒、核糖核蛋白（RNP）、噬菌体衣壳、接合元件或整合转座酶/CRISPR相关转座子（CAST）系统以及原间隔相邻基序（PAM）限制决定了在非模型共生菌中的可靶向性；高保真Cas变体和谨慎的gRNA设计可降低脱靶活性。

微生物基因组编辑的原则涉及克服菌株特异性障碍。质粒系统在Lactobacillus和Bifidobacterium工程中占主导地位，利用优化的电穿孔方案和源自天然质粒的复制子（如来自Bacteroides的pBAC）确保稳定的异源基因表达。接合载体使DNA从供体大肠杆菌转移到顽固的共生菌（如Bacteroides thetaiotaomicron），利用oriT序列和可移动转座子进行染色体整合。对于噬菌体抗性菌株，工程化M13或λ噬菌体递送CRISPR组件；最新进展利用修饰有共生菌特异性受体结合蛋白的噬菌体衣壳靶向Clostridium butyricum亚型。关键挑战包括PAM不相容性（通过具有T-rich PAM偏好的Cas12a变体解决）和水平基因转移（HGT）风险。后者通过营养缺陷型选择标记、CRISPR介导的编辑后质粒降解自消除电路以及基因组安全港（如attB位点）以最小化脱靶整合来缓解。菌株特异性表达通过从Bacteroides核糖体RNA操纵子或Lactobacillus糖酵解基因挖掘的合成启动子实现。BE和PE最近扩展了工具箱：在Bacteroides中，胞苷脱氨酶融合的dCas9可纠正ptsG突变以调节碳水化合物代谢而不产生DSBs，减少意外的基因组重排。

超越CRISPR的合成生物学工具进一步增强了工程化菌株的能力。群体感应（QS）模块，如最初在Vibrio fischeri中表征的LuxI/LuxR家族，被广泛用作模块化群体水平门控机制，仅在达到定义的细菌密度或环境信号后触发治疗性基因表达，这一特性减少了癌症应用中免疫调节剂的脱靶分泌。诊断报告模块，如luxCDABE生物发光操纵子或酶报告基因融合，可置于肿瘤或炎症响应启动子控制下，以非侵入性指示局部病理状态。分裂-Cas12a生物传感器是诊断结构，其中Cas12a活性被设置为条件性（例如通过分裂蛋白质或使用条件性引导激活），使得疾病相关核酸检测触发Cas12a的附带ssDNase活性和荧光或侧流层析读数，这种设计能够灵敏检测循环肿瘤DNA/RNA，并可用于门控治疗反应。可编程CRISPR相关转posase（CAST）系统允许将多千碱基大小的有效载荷位点特异性染色体插入基因组安全港，改善长期表达稳定性并降低基于质粒的HGT风险。

靶向血癌的机制与策略

工程化微生物对抗血癌的机制策略主要包括免疫系统调节、直接肿瘤攻击、代谢工程以及联合疗法。

在免疫调节方面，战略性地工程化共生微生物以表达免疫调节剂代表了血癌免疫治疗的范式转变。修饰分泌IL-15的Lactococcus lactis通过上调NKG2D和颗粒酶B表达增强NK细胞介导的对AML原始细胞的细胞毒性，同时减少骨髓（BM）生态位中IL-6驱动的炎症反应。类似地，分泌IFN-γ的Bifidobacterium longum增强DC上的MHC-II呈递，促进淋巴瘤模型中的肿瘤抗原识别和Th1极化，体内观察到肿瘤负荷减少40%。CRISPRi系统能够精确控制检查点抑制剂表达；用dCas9驱动的PD-L1纳米抗体工程化的大肠杆菌Nissle 1917（EcN）在肿瘤微环境（TME）内实现PD-1/PD-L1相互作用的局部阻断，在播散性骨髓瘤模型中显著延长生存期而无系统性自身免疫。最近创新包括在Bacteroides fragilis中诱导内源性细胞因子基因的CRISPRa系统，导致持续IL-12产生，扩增中央记忆T细胞并改善白血病宿主的持久反应。

直接肿瘤攻击方法利用酶有效载荷进行局部癌细胞破坏同时保留健康组织。用胞嘧啶脱氨酶工程化的Salmonella typhimurium在前药5-氟胞嘧啶（5-FC）转化为5-氟尿嘧啶（5-FU）在白血病微环境中实现90%原始细胞减少，同时维持血浆药物浓度比全身给药低300倍。噬菌体递送的CRISPR-Cas系统能够对恶性细胞进行精确基因组编辑；装载靶向BCR-ABL融合癌基因的Cas9-gRNA的M13噬菌体衣壳在慢性髓系白血病干细胞中实现>95%编辑效率，诱导凋亡而不伤害BCR-ABL阴性造血前体细胞。肿瘤裂解酶分泌通过启动子工程优化；具有缺氧诱导启动子的Listeria monocytogenes驱动孔形成李斯特菌溶胞素O的局部表达，通过膜失稳选择性裂解化疗耐药AML细胞。

代谢工程方法利用血液恶性肿瘤的代谢脆弱性。用丁酰辅酶A转移酶过表达修饰的产丁酸盐Clostridium butyricum将结肠丁酸盐浓度提高4倍，诱导白血病干细胞组蛋白超乙酰化并逆转肿瘤抑制基因如PTEN和CDKN1A的表观遗传沉默。吲哚-3-醛（IAld）是Lactobacillus spp.通过细菌色氨酸代谢产生的色氨酸衍生吲哚，是有效的芳烃受体（AhR）配体。IAld驱动的AhR激活增强先天淋巴样细胞和NK细胞的IL-22/IFN-γ反应，并已在临床前模型中显示改善黏膜和全身抗肿瘤 immunity。新型生物合成途径能够生产具有抗白血病特性的植物源黄酮类化合物；表达来自拟南芥细胞色素P450酶的Saccharomyces cerevisiae共培养产生治疗水平的芹菜素，其抑制BCL-2并诱导慢性淋巴细胞白血病细胞线粒体凋亡。代谢联盟工程协调多个物种以增强输出；具有CRISPR激活的乙酸激酶通路的Bacteroides thetaiotaomicron和Eubacterium rectale共培养将膳食纤维转化为抗炎柚皮素，通过NF-κB抑制抑制IL-1β驱动的白血病增殖。

联合疗法战略性地整合微生物组工程与常规免疫疗法以克服难治性血癌的耐药机制。来自CAR-T应答者的FMT恢复Ruminococcus主导的群落，通过丁酸盐诱导的PGC-1α激活增强CAR-T线粒体生物合成，增加CAR-T持久性并将大B细胞淋巴瘤患者的复发率从70%降低到30%。表达CD19模拟肽的工程化益生菌敏化恶性细胞至blinatumomab；表面展示CD19表位的Bacteroides ovatus在异种移植模型中将双特异性抗体结合效率提高3倍。微生物组介导的检查点阻断放大利用修饰分泌抗CTLA-4纳米抗体的Akkermansia muciniphila，增加肿瘤内Treg耗竭并增强Richter转化淋巴瘤中的T效应细胞浸润。代谢物-抗体协同通过产生戊酸的Roseburia intestinalis实现，其抑制HDAC6以稳定多发性骨髓瘤细胞中的微管，与daratumumab协同增强巨噬细胞的抗体依赖性细胞吞噬作用。II期试验证明，CAR-T治疗期间补充Bifidobacterium的自体FMT通过调节IL-10和TGF-β信号通路将难治性弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）的完全缓解率从45%提高到65%。

临床前与临床进展

CRISPR工程化微生物组疗法在血液恶性肿瘤中的转化管道显著加速，开创性研究证明了在复杂哺乳动物系统中的可行性，早期临床试验正在探索安全性和生物活性。然而，早期人体数据仍然有限，小试验结果的可变性需要在更大规模随机研究提供更可靠疗效和安全性评估之前谨慎解读。

白血病小鼠模型结合CRISPR编辑的共生菌为原位肿瘤靶向提供了令人信服的概念验证。在一项里程碑式研究中，研究人员使用慢病毒CRISPR-Cas9系统同时破坏小鼠HSC中多达五个肿瘤抑制基因（如Tet2、Runx1、Dnmt3a、Nf1、Ezh2），生成基因复杂AML模型，忠实地再现人类疾病异质性。在早期可行性工作基础上，几个研究小组工程化了共生大肠杆菌菌株（包括EcN）在原位分泌治疗性单域抗体或检查点阻断片段。这些报告验证了细菌原位纳米抗体递送的通用策略；然而，在已建立淋巴瘤模型中细菌分泌CD19特异性纳米抗体的直接、经同行评审的证明目前有限。这些模型凸显了CRISPR编辑的共生菌克服限制常规疗法的生物学障碍的潜力，特别是持续微小残留病（MRD）的庇护所（如骨髓生态位）的可及性。

从小鼠模型过渡到人类应用，早期临床试验正在评估血液恶性肿瘤中的微生物组调节策略。SYN-004（ribaxamase）II期试验代表了一种开创性方法，涉及口服β-内酰胺酶，旨在在接受静脉注射β-内酰胺的患者中保护肠道微生物组免受抗生素介导的生态失调。虽然最初开发用于预防艰难梭菌感染，但这种策略对接受强化化疗或CAR-T细胞治疗的血癌患者具有深远意义，其中抗生素诱导的微生物损伤与复发风险增加和治疗效果降低相关。在淋巴瘤患者亚组分析中，与安慰剂对照组相比，SYN-004给药保留肠道微生物多样性指数>40%，并显著减少致病性Enterobacteriaceae的肠道扩增。值得注意的是，维持较高微生物α-多样性的患者在异基因干细胞移植受者中表现出改善的中性粒细胞恢复时间（平均14.2天 vs. 18.7天）和降低的GVHD严重程度，表明微生物组完整性影响造血重建。更直接的微生物组工程方法正在出现，一项针对表达CD20纳米抗体的CRISPR编辑Bifidobacterium longum的首次人体试验正在招募难治性淋巴瘤患者。微生物治疗剂在旨在增强细菌定植和有效载荷递送至肠道相关淋巴组织的环磷酰胺预处理后口服给药，初步结果显示在肠系膜淋巴结中可检测到纳米抗体分泌，并在5名评估患者中有2名观察到部分缓解。

挑战、伦理考量与未来方向

CRISPR工程化共生菌的治疗应用带来了前所未有的机遇，同时也面临多方面的挑战。在临床转化之前，必须系统地解决技术限制、生物安全问题和伦理监管复杂性。

技术障碍包括菌株稳定性、递送精度和脱靶效应。工程化共生菌的功能功效取决于克服关键的技术障碍。菌株稳定性和定植动态仍然不可预测，因为编辑过的共生菌在已建立的微生物组中面临激烈竞争。研究显示，即使是强大的底盘菌株如EcN也表现出可变的植入率，在抗生素预处理小鼠中≤40%定植率，在复杂人类微生物组中进一步降低。代谢瓶颈，特别是来自本土细菌的营养竞争，损害工程菌株持久性和治疗性蛋白输出。最近方法采用进化工程来增强细菌适应性，但这可能无意中改变治疗功能。

递送系统限制直接影响编辑效率。接合质粒如优化的TP114在体外实现>99%靶向消除，但在体内显示效力降低。在动物模型中测量，体内效力约为70-90%，并受到物理屏障（如黏液层）和可变细菌接触率的损害。病毒载体能够组织特异性靶向但引发免疫清除；脂质纳米颗粒（LNP）免疫原性较低，但细菌摄取率低。一项2024年研究表明，基于水凝胶的封装改善了CRISPR编辑乳酸杆菌的十二指肠滞留，但未能增强结肠递送（血液相互作用的关键部位）。

遗传异质性和脱靶效应带来额外风险。菌株特异性基因组变异可改变PAM位点可及性，降低非模型共生菌中Cas9切割效率。虽然生物信息学工具（如CRISPRiTF）预测gRNA特异性，但体内研究证实5-15%的编辑共生菌中存在脱靶突变，包括代谢基因或毒力因子中的意外缺失。值得注意的是，"逃逸"突变体（通过gRNA或Cas9突变在CRISPR靶向下存活的细菌）在体内频率高达10^-4，可能产生耐药病原体。BE减少DSBs但在腺嘌呤丰富区域引入旁观者突变（≥3 bp/编辑事件）。

生物安全与防护需要自杀基因系统以防止微生物持久存在。工程化微生物的失控持久存在风险HGT、全身传播和意外免疫调节。自杀开关提供可编程生物防护，但其可靠性需要优化。四环素依赖性杀死开关在治疗后有效清除编辑的Bacteroides，但存在"渗漏"表达（0.1%存活），使得质粒在体内转移至病原体。温度敏感开关在发热患者中面临限制，生理温度可能触发过早细菌死亡。

现在出现双层防护策略。一项研究将胸苷营养缺陷与CRISPR基于自靶向整合，编辑的共生菌需要外源胸苷，同时表达靶向必需基因的gRNA。这在胸苷撤回后72小时内使小鼠粪便中活菌计数减少10,000倍，优于单机制系统。或者，"死人"和"密码"开关利用代谢物组合（如茶碱+N-乙酰葡糖胺）以防止意外激活，但增加了制造复杂性。

HGT风险需要特别关注。用于CRISPR递送的接合质粒以高达10^-6的频率在体外将抗生素抗性标记转移至病原体。缺乏细菌起源的最小化载体降低了这种风险但损害了货物容量。最近创新包括CRISPR编码的HGT阻断器：工程化共生菌表达Cas9与靶向可移动元件（如oriT序列）的gRNAs，在肠道模型中将质粒转移减少>99%。然而，对噬菌体的残留转移可能生态传播编辑 machinery。

长期免疫毒性仍然特征不清。小鼠研究表明，持续Cas9表达在免疫活性宿主中触发T细胞介导的结肠炎，而裂解细菌的片段化DNA可能激活TLR9通路，加剧白血病患者的CRS。重要的是，对免疫受损患者施用活的工程化或非工程化细菌带来独特且充分证明的危险，需要明确讨论。免疫受损宿主（例如长期中性粒细胞减少症、高剂量皮质类固醇或抗细胞因子治疗、近期allo-HSCT或强化化疗患者）细菌易位、血流感染和来自通常共生物种的局灶性侵袭性感染风险增加；病例报告和系统评价将益生菌株（特别是Lactobacillus/Lacticaseibacillus spp., Bacillus spp., 和Clostridium spp.）与此类患者的菌血症和严重脓毒症联系起来。这些风险因中心静脉导管、黏膜屏障损伤、ICU入住和并发广谱抗生素而放大。因此，任何考虑在肿瘤学人群中施用活微生物的临床项目应明确权衡(i)菌血症和脓毒症及相关发病率和死亡率的非零风险，(ii)传播风险和需要长期抗生素治疗或设备移除，(iii)逃逸或逃逸突变体机会性感染可能性，以及(iv)工程化元件向共殖民生物的生态传播和水平转移。缓解策略应预先指定，并可包括在早期试验中排除严重中性粒细胞减少或重度免疫抑制患者，使用抗生素敏感或非复制递送格式（如灭活细菌、纯化后生元或非复制衣壳/RNP递送），对侵袭性和可转移耐药决定子进行严格临床前安全筛选，强制性中心线预防措施，强化微生物学监测，以及紧急揭盲/根除计划。瞬时表达系统和RNA靶向Cas13通过避免基因组改变缓解这些担忧。

未来