靶向分子伴侣介导的自噬通过抑制胶质母细胞瘤干细胞特性并重塑抗肿瘤免疫实现治疗新突破

《Nature Communications》：Targeting chaperone-mediated autophagy inhibits properties of glioblastoma stem cells and restores anti-tumor immunity

本研究聚焦胶质母细胞瘤(GBM)治疗中免疫检查点抑制剂(ICI)疗效不佳及胶质母细胞瘤干细胞(GSCs)介导的治疗抵抗难题。研究人员系统解析了MST4激酶通过磷酸化LAMP2A（溶酶体相关膜蛋白2A）增强分子伴侣介导的自噬(CMA)活性的新机制，发现CMA通过降解mTORC1负调控因子TSC1/2维持GSCs干性，并通过降解DNA去甲基化酶TET3表观沉默cGAS-STING通路促进免疫逃逸。靶向CMA可协同增强放疗与抗PD-1疗法疗效，为GBM免疫治疗提供了新靶点。

　　

胶质母细胞瘤(GBM)作为最具侵袭性的原发性脑肿瘤，患者预后极差，标准治疗方案效果有限。更棘手的是，免疫检查点抑制剂对这类肿瘤几乎无效，其深层机制与肿瘤内部一群具有自我更新能力的胶质母细胞瘤干细胞(GSCs)密切相关。这类细胞不仅对放化疗具有天然抵抗力，还能巧妙躲避免疫系统的攻击，成为治疗失败和肿瘤复发的根源。因此，破解GSCs的生存奥秘，寻找有效干预靶点，是改善GBM治疗的关键突破口。

近日发表于《Nature Communications》的研究首次系统揭示了分子伴侣介导的自噬(Chaperone-mediated autophagy, CMA)在GSCs恶性进展中的核心作用。CMA是细胞内一种选择性降解特定蛋白质的自噬途径，其关键受体LAMP2A（溶酶体相关膜蛋白2A）在GSCs中异常高表达。研究人员发现，MST4激酶可直接磷酸化LAMP2A蛋白（T40、S97、T136位点），增强其稳定性并促进多聚化，从而激活CMA。机制上，CMA通过降解mTORC1通路负调控因子TSC1和TSC2，维持GSCs的干性和肿瘤发生能力；同时，CMA还靶向降解DNA去甲基化酶TET3，导致cGAS和STING基因启动区高甲基化，抑制cGAS-STING通路活化，从而帮助肿瘤实现免疫逃逸。研究进一步证实，遗传学或药理学抑制CMA可有效抑制肿瘤生长，并与放疗或抗PD-1治疗产生协同效应，显著延长荷瘤小鼠生存期。该研究不仅阐明了CMA调控GSCs的新机制，也为GBM的联合治疗提供了新的策略。

研究主要采用了患者来源的GSCs体外培养模型、免疫缺陷及免疫健全小鼠原位移植瘤模型。关键技术包括免疫印迹(IB)、免疫共沉淀(IP)、免疫荧光(IF)进行蛋白定位与互作分析；体外激酶实验验证MST4对LAMP2A的直接磷酸化；溶酶体分离纯化技术分析CMA底物降解；shRNA/sgRNA介导的基因敲低/敲除；荧光报告系统（PA-mCherry-KFERQ）动态监测CMA活性；流式细胞术分析肿瘤免疫微环境；以及针对临床样本的免疫组化(IHC)分析。

CMA在GSCs中活性上调并与溶酶体LAMP2A丰度增加相关

研究人员发现，与常规GBM细胞系相比，患者来源的GSCs基线CMA活性显著升高。其溶酶体对CMA模型底物GAPDH的结合和摄取能力增强，且CMA活性与GSCs干性维持正相关。分化后的GSCs(DGCs)CMA活性下降。机制上，GSCs溶酶体LAMP2A蛋白丰度显著增加，而其mRNA水平无变化，提示存在转录后调控。功能实验证实，敲低LAMP2A可抑制GSCs增殖、成球及体内成瘤能力，而回补野生型LAMP2A（LAMP2A-WT）而非功能缺失突变体（LAMP2A-4A）可逆转此表型。

MST4介导的LAMP2A磷酸化增强了其在溶酶体膜上的稳定性

为探究LAMP2A上调机制，研究发现GSCs中LAMP2A蛋白在溶酶体内的稳定性高于DGCs，且其磷酸化水平更高。质谱分析鉴定出MST4激酶与LAMP2A相互作用。MST4敲低或敲除导致LAMP2A磷酸化水平及其溶酶体丰度下降，加速其被组织蛋白酶A(Cath A)降解，并损害LAMP2A的多聚化，从而抑制CMA活性。过表达MST4可增强CMA，此效应依赖于LAMP2A。

MST4直接磷酸化GSCs中的LAMP2A

质谱分析和体外激酶实验证实，MST4直接磷酸化LAMP2A的T40、S97和T136位点，其中T136位点最为关键。构建的磷酸化特异性抗体（抗LAMP2A pT136）验证了此磷酸化事件。功能回补实验显示，回补磷酸化模拟突变体LAMP2A-3D可有效恢复CMA活性和GSCs恶性表型，而磷酸化缺陷突变体LAMP2A-3A则不能。

MST4介导的LAMP2A磷酸化促进CMA活性、GSCs自我更新和成瘤性

在MST4敲低的GSCs中回补LAMP2A-3D，可比回补LAMP2A-WT更有效地恢复溶酶体LAMP2A水平、CMA活性、细胞增殖、成球能力及体内肿瘤生长。相反，在低表达MST4的GSC 23细胞中过表达MST4可增强CMA和成瘤性，而此效应可被LAMP2A敲低所抵消。研究还发现p38α MAPK可介导GSC 23细胞中LAMP2A的基础磷酸化。此外，MST4同时激活巨自噬和CMA，两者存在补偿作用，共同敲低ATG4B和LAMP2A可协同抑制肿瘤生长。

CMA通过调控TSC1/2增强mTORC1信号

RNA测序和蛋白质组学分析提示LAMP2A敲低影响mTOR等信号通路。实验证实，敲低MST4或LAMP2A会降低mTORC1下游靶点p-P70S6K和p-4EBP1水平。生物信息学预测及实验验证发现TSC1和TSC2含有KFERQ样基序，是CMA的新底物。CMA通过HSC70-LAMP2A途径介导TSC1/2的溶酶体降解，从而解除对mTORC1的抑制。敲低TSC1/2可部分逆转LAMP2A敲低对mTORC1信号和GSCs表型的抑制作用。回补逃逸CMA降解的TSC1/2突变体对mTORC1激活和GSCs干性的促进作用更强。

抑制CMA功能通过增强抗肿瘤T细胞免疫减少GBM肿瘤生长

生物信息学分析显示CMA评分与CD8⁺T细胞浸润负相关，与免疫抑制细胞（TAMs, MDSCs）正相关。体外共培养实验表明，敲低LAMP2A或MST4可增强CD8⁺T细胞对GSCs的杀伤作用。在免疫健全小鼠模型中，敲低Mst4或Lamp2a可显著抑制肿瘤生长并延长生存期，此效应在免疫缺陷鼠中减弱，且依赖于CD8⁺T细胞。敲低Mst4/Lamp2a可增加肿瘤内CD8⁺T细胞浸润和细胞毒性，减少免疫抑制细胞和PD-L1表达。

CMA通过靶向TET3进行溶酶体降解来调控cGAS/STING表达

LAMP2A敲低上调了cGAS和STING的表达及IR诱导的TBK1/STING磷酸化。机制上，CMA靶向降解DNA去甲基化酶TET3，而TET3正调控cGAS和STING的表达。TET3含有KFERQ样基序，与HSC70和LAMP2A结合，并发生CMA依赖性降解。敲低TET3可抑制CMA抑制引起的cGAS-STING通路激活。在体实验证实，Tet3或Cgas敲低可逆转Lamp2a敲低带来的抗肿瘤免疫效应和生存获益。

MST4对LAMP2A的磷酸化通过抑制TET3表达来抑制cGAS-STING信号

在LAMP2A敲低的GSCs中回补LAMP2A-3D（而非WT）可削弱MST4敲低对cGAS-STING通路的激活作用。过表达MST4抑制cGAS-STING通路，此效应依赖于LAMP2A。TET3敲低可拮抗CMA抑制（遗传或药理学抑制）对cGAS-STING通路的激活。这些结果明确了CMA-TET3-cGAS-STING轴在调控抗肿瘤免疫中的作用。

CMA抑制增强小鼠GBM模型中的放疗和免疫检查点治疗效果

在免疫健全的GBM模型中，CMA抑制剂PPD（Polyphyllin D）单用或联合放疗、抗PD-1抗体，可显著抑制肿瘤生长、促进CD8⁺T细胞浸润，并显著延长小鼠生存期。联合治疗展现出协同抗肿瘤效果。

MST4、p-LAMP2A、TET3和TSC1/2表达的相关性及其与GBM患者生存的关系

对临床GBM样本的免疫组化分析显示，MST4与LAMP2A pT136表达呈正相关，而与TET3、TSC1/2表达负相关。生存分析表明，MST4和p-LAMP2A高表达与患者不良预后相关，而TET3和TSC1/2高表达与较好预后相关。

该研究系统阐明了MST4-LAMP2A信号轴通过调控CMA活性，在维持GSCs干性、促进肿瘤发生和介导免疫逃逸中的核心作用。CMA通过降解TSC1/2激活mTORC1信号，并通过降解TET3抑制cGAS-STING通路，双重作用共同维持GSCs的恶性特征和免疫抑制微环境。研究证实靶向CMA可有效抑制肿瘤生长，并与现有疗法（放疗、免疫治疗）产生协同效应，为克服GBM治疗抵抗提供了新的联合治疗策略和潜在靶点。