冷冻关联光电子层析成像揭示多巴胺能轴突膨体通过非突触方式调控皮质-纹状体突触

《Nature Communications》：Cryo-correlative light and electron tomography of dopaminergic axonal varicosities reveals non-synaptic modulation of cortico-striatal synapses

本研究针对多巴胺释放位点的超微结构特征不明确这一关键问题，利用冷冻关联光电子显微镜和冷冻电子层析技术，首次在近天然状态下解析了成年小鼠纹状体中多巴胺能(DA)和谷氨酸能(GLU)突触体的三维结构。研究发现DA突触体含有更少、更大且形态不规则的囊泡，仅37%存在膜锚定囊泡且缺乏启动状态囊泡，而DA与GLU突触体形成的多巴胺枢纽突触(DHS)中GLU末端的启动囊泡比例显著增加。该研究揭示了DA末端的非经典突触调节机制，为理解神经调制提供了新的结构基础。

　　

在大脑的精密调控网络中，多巴胺作为关键神经调质，在奖赏预测和运动启动中扮演着核心角色。特别是从黑质和腹侧被盖区发出的多巴胺能投射密集支配纹状体，通过调节棘状投射神经元(SPN)的活性来影响运动控制、奖赏预测和动机等关键功能。然而，与谷氨酸能(GLU)突触超微结构的清晰表征形成鲜明对比的是，多巴胺能(DA)传输的精细结构基础至今仍笼罩在迷雾之中。

传统观点认为，神经递质释放通常发生在具有典型突触前活性区(AZ)和突触后密度(PSD)结构的化学突触。但令人困惑的是，早期电子显微镜研究显示，DA轴突终末呈现出高度的异质性：部分膨体含有少量囊泡，有些则几乎空无一物，且仅少数具备典型的突触特征。更 intriguing 的是，使用荧光多巴胺类似物的研究发现，仅约25%的DA膨体能够在电刺激后释放递质，暗示着DA终端存在显著的功能多样性。这些现象引出了一个核心科学问题：DA神经调制的超微结构基础究竟是什么？它是通过典型的突触结构，还是通过其他非典型机制发挥作用？

为了回答这一难题，Paul Lapios等研究人员在《Nature Communications》上发表了最新研究成果。他们采用冷冻关联光电子显微镜(cryo-CLEM)和冷冻电子层析技术(cryo-ET)，首次在近天然状态下系统解析了成年小鼠纹状体中DA和GLU突触体的三维结构，特别关注了被称为"多巴胺枢纽突触"(DHS)的DA-GLU复合结构。

研究的关键技术方法包括：利用表达VGLUT1^Venus（囊泡谷氨酸转运体1）和DAT-Cre（多巴胺转运蛋白）的小鼠模型，通过荧光激活突触体分选技术从成年小鼠纹状体中分离特异性标记的DA和GLU突触体；采用冷冻关联光电子显微镜实现荧光标记突触体的定位与关联；运用冷冻电子层析技术获得近天然状态下的高分辨率三维结构；通过层次连接算法自动化分析囊泡锚定和连接结构；最后利用3D建模和定量分析比较不同突触体的超微结构特征。

GLU与DA突触体的形态学差异显著

研究人员重建了103个GLU突触体和110个DA突触体的三维结构，发现两者在大小和囊泡含量上存在显著差异。GLU突触体平均直径823纳米，含有191个小型圆形囊泡(直径40.4±7.0纳米)，囊泡密度为1964个/μm3。相比之下，DA突触体明显更小(平均直径575纳米)，仅含28个囊泡，且囊泡更大(45.1±9.7纳米)、形态更不规则(球形指数WI更低)，密度仅为682个/μm3。特别值得注意的是，71个DA突触体中含有直径大于60纳米的大囊泡，72个含有明显拉长的囊泡，这种形态异质性可能反映了DA囊泡内不同的渗透压环境。

接触区结构特征揭示DHS的特殊性

在GLU突触体中，62%(64/103)与清晰的突触后元件(PSE)形成典型突触，突触间隙宽31.8±6.2纳米，并可见明显的突触后密度(PSD)。相反，仅2个DA突触体显示类似的突触结构，且这些"类GLU"的DA突触体可能来源于共表达VGLUT2的神经元。在32个DHS结构中，87%的DA终端与GLU突触前元件直接粘附，接触区面积与GLU活性区相似(约0.05μm2)，但间隙宽度仅12.1±2.4纳米，明显窄于典型突触间隙。这些接触区虽可见致密物质，但缺乏典型的PSD结构，表明DHS是一种特殊的粘附性接触而非典型突触。

囊泡组织状态反映功能差异

囊泡与质膜的锚定状态是评估其释放准备程度的重要指标。在GLU突触体中，52%的近膜囊泡(距质膜<45纳米)被锚定，且距离质膜<5纳米的囊泡平均有3个锚定丝，符合"启动"状态特征。而DA突触体中仅37%(18/49)含有锚定囊泡，锚定囊泡比例(25%)显著低于GLU，且几乎完全缺乏距质膜<5纳米的近端囊泡。DA囊泡的锚定丝也更长(22.4±12.7纳米 vs 13.9±7.5纳米)。此外，GLU囊泡间的连接程度(64%)也显著高于DA(24%)，表明两者的囊泡组织机制存在本质差异。

含锚定囊泡的DA突触体构成功能亚群

根据是否含有锚定囊泡，DA突触体可分为T+(含锚定囊泡)和T-(无锚定囊泡)两个功能亚群。T+突触体更大、囊泡更多且密度更高，囊泡更靠近质膜，且锚定囊泡本身更大、更圆。这一比例(约37%)与既往报道中含活性区蛋白的DA膨体比例(~30%)以及能释放荧光多巴胺类似物的功能性DA膨体比例(~25%)高度一致，强烈提示T+突触体对应着高释放概率的DA终端。有趣的是，DA锚定囊泡并不聚集在DA-GLU接触区，而是随机分布在质膜各区域，且多个锚定囊泡间的平均距离(216±193纳米)虽小于随机分布预期，但远大于GLU突触体中的囊泡聚集程度(100±12纳米)，表明DA终端可能缺乏GLU突触那样高度组织化的活性区。

DHS连接改变GLU终端的囊泡组织

最为关键的发现是，DHS中的GLU终端(GLU DA+)显示出独特的囊泡组织特征。虽然其囊泡总数和密度与孤立GLU终端(GLU DA-)无差异，但近端囊泡的体积占比显著更高，且囊泡间连接程度(46.7% vs 21.6%)和"既锚定又连接"的囊泡比例(26.7% vs 5.4%)明显增加。这种结构变化与提升的神经递质释放能力相关，表明DA终端通过物理粘附直接调节相邻GLU突触的囊泡组织状态。

本研究通过冷冻电子层析技术首次在近天然状态下揭示了多巴胺能终端的三维超微结构，解决了该领域长期存在的争议。研究发现DA终端缺乏典型突触结构，囊泡数量少且异质性强，仅部分含有锚定囊泡，这些特征与DA调制的时空特性相符。尤为重要的是，研究发现了DA终端通过形成DHS特异性粘附于皮质-纹状体突触，并局部调节GLU末端的囊泡组织状态。

这些发现对理解神经调制的基本原理具有重要意义：首先，DA终端的结构特征支持其采用"非对称"释放策略，即少数高度组织的释放点与大量低效释放点并存；其次，DHS的发现为理解多巴胺和谷氨酸系统的时空协同提供了结构基础，这种多组分组装确保了多巴胺释放位点与特定谷氨酸突触的紧密空间关联，可能在对纹状体神经元兴奋性输入的可塑性调节中发挥关键作用。该研究不仅深化了对多巴胺能神经调制的认识，也为相关神经精神疾病的机制研究提供了新的结构框架。