小鼠海马神经元突触囊泡融合的动态纳米尺度结构解析

《Nature Communications》：Dynamic nanoscale architecture of synaptic vesicle fusion in mouse hippocampal neurons

突触囊泡（SV）融合是神经通讯的核心事件，但其纳米尺度动态结构一直难以直接观测。本研究通过光遗传学刺激结合原位冷冻电子断层扫描（cryo-ET）技术，首次在毫秒时间尺度捕获了SV从锚定到融合孔形成、扩张及坍塌的全过程。研究发现SV融合通过脂质茎干（stalk）直接启动，无需紧密对接或半融合状态，并揭示融合中的囊泡通过丝状连接介导邻近SV的快速补充。该工作为理解神经递质释放机制提供了关键结构证据。

　　

神经元之间的信息传递依赖于突触前末梢的突触囊泡（Synaptic Vesicle, SV）与突触前膜融合并释放神经递质。这一过程发生在毫秒级时间尺度，且受到SNARE蛋白复合物、突触结合蛋白-1（synaptotagmin-1）等分子的精密调控。尽管其分子机制已被广泛研究，但囊泡与质膜融合的动态结构路径仍存在争议。现有理论模型包括囊泡与质膜紧密对接后形成半融合（hemifusion）中间态，或通过局部脂质重排直接形成茎干（stalk）结构。由于缺乏能够在近生理状态下直接观察全融合过程的技术，这些模型的真实性一直难以验证。

近日发表在《Nature Communications》的一项研究中，由Jana Kroll和Christian Rosenmund领导的研究团队开发了一套结合光遗传学刺激与原位冷冻电子断层扫描（cryo-ET）的工作流程，首次以高时空分辨率捕捉了小鼠海马神经元中突触囊泡融合的完整序列，揭示了其动态纳米尺度结构。

为开展本研究，作者首先构建了表达光敏感通道通道视紫红质-2（ChR2）变体与谷氨酸荧光探针iGluSnFR3的小鼠原代海马神经元模型，并在电镜载网上进行培养。通过改造的 plunge freezing 系统，在样品投入乙烷前施加两次光脉冲（间隔约7毫秒），实现动作电位的精确诱导与快速冷冻固定。利用冷冻共聚焦显微镜确认刺激后iGluSnFR3荧光信号增强，表明神经递质释放成功。随后，作者采集了312个刺激样本与95个TTX（河豚毒素）抑制对照样本的冷冻电子断层扫描数据，通过三维重构与形态计量学分析，系统鉴定了七类膜重构事件，并利用粗粒度模拟探讨了融合启动的动力学机制。

突触囊泡融合中间体的原位冷冻电子断层扫描分析

研究人员从刺激样本的75个突触中识别出七类膜重构状态：突触前膜内陷（1）、茎干形成（2）、闭合融合孔（3）、开放融合孔（4）、扩张融合孔（5）、坍塌融合孔（6）及小型隆起（7）。通过形态计量与亚断层图平均分析，发现刺激样本中52%的突触存在正在进行中的融合事件（类别2-6），而TTX处理样本中仅10.7%的突触存在此类事件。融合过程中SV呈液滴状，与突触前膜平均距离为4纳米，且膜间出现模糊区域，提示脂质开始混合。值得注意的是，仅发现一例紧密对接的SV，表明茎干形成是动作电位诱发融合的主要启动机制。

通过茎干形成启动突触囊泡融合

与强调紧密对接或半融合状态的模型不同，本研究观察到SV在距离突触前膜约4纳米时直接通过茎干结构启动融合。粗粒度模拟进一步表明，膜曲率诱导蛋白（如突触结合蛋白-1）的高拷贝数反而会阻碍SNARE复合物形成与囊泡招募，支持膜内陷可能源于SNARE拉链化而非蛋白驱动的膜弯曲。

刺激后突触中近膜囊泡的耗竭

统计分析显示，刺激样本中距离突触前膜6纳米内的近膜SV数量显著减少，表明动作电位诱发后功能性预置囊泡库发生耗竭。此外，囊泡与突触前膜间丝状连接的数量与距离呈负相关，但融合中与未融合突触间的平均连接数无显著差异，提示连接分子的组成而非数量可能决定囊泡的预置状态。

多囊泡释放与释放位点再补充

23%的融合突触中存在多囊泡释放（MVR）事件。更重要的是，62%的融合中间体与邻近SV间存在丝状互连结构，且这些连接在融合早期状态中更为常见。最近邻分析表明，带有互连结构的融合事件其邻近SV距离更近，提示丝状连接在融合启动阶段直接参与囊泡的快速招募，以维持高频刺激下的递质释放。

本研究通过光遗传学刺激与原位冷冻电子断层扫描的巧妙结合，实现了对突触囊泡融合全过程的纳米尺度动态解析。结果支持融合通过茎干形成直接启动，无需紧密对接或半融合状态，并揭示了丝状连接在囊泡再补充中的机械协调作用。该工作不仅澄清了长期存在的融合机制争议，其技术流程更为研究其他快速细胞过程提供了通用策略。未来通过进一步提高信噪比与自动化分析精度，有望在分子水平解析融合蛋白的实时构象变化，最终揭示神经递质释放的完整动态图景。