蒺藜苜蓿根瘤共生体功能维持依赖于共生体空间中果胶的持续清除机制

《Nature Communications》：Symbiosome functionality in Medicago truncatula nodules requires continuous clearing of pectins from the symbiosome space

本研究针对豆科植物-根瘤菌共生体系中，共生体空间如何维持无细胞壁环境这一关键问题，揭示了蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)通过分泌共生特异性多聚半乳糖醛酸酶SyPG1/SyPG2，持续清除共生体空间中的去酯化果胶，从而维持根瘤菌活性与高效固氮的创新机制。该发现发表于《Nature Communications》，为理解共生互作的精细调控提供了新视角。

　　

在豆科植物与根瘤菌的共生关系中，植物根部形成特殊的根瘤结构，作为细菌固定大气中氮素的"微型工厂"。在这个工厂的核心车间——共生体(symbiosome)中，根瘤菌被一层宿主衍生的共生体膜包裹，分化成能够固氮的类菌体(bacteroid)。共生体膜与菌体之间的区域被称为共生体空间(symbiosome space)，其拓扑结构类似于植物细胞壁外的质外体(apoplast)区室。然而，与充满细胞壁成分的普通质外体不同，成熟的共生体空间被认为是缺乏典型植物细胞壁组分（如果胶、木葡聚糖等）的"洁净"环境。这种无细胞壁的环境对于维持高效的固氮作用至关重要，但植物宿主如何建立并维持这一特殊微环境，长期以来一直是个未解之谜。

传统观点认为，细菌从无细胞壁的"感染滴"(infection droplet)释放后，形成的共生体自然保持无细胞壁状态。但有证据表明，在年轻的共生体中可能存在某些细胞壁成分（如鼠李糖半乳糖醛酸聚糖II，RG-II）的短暂积累，随共生体成熟而消失。这提示可能存在两种机制：要么宿主细胞在共生体成熟后完全停止了细胞壁成分的合成与分泌，要么共生体内存在活跃的降解机制持续清除这些成分。发表于《自然·通讯》的这项研究为后一种机制提供了令人信服的证据。

关键技术方法

研究人员综合利用了多种分子生物学和细胞生物学技术，包括启动子-报告基因（GUS）分析、原位杂交、蛋白质亚细胞定位（通过GFP融合蛋白）、RNA干扰(RNAi)和CRISPR-Cas9基因编辑、免疫荧光和免疫电镜（使用LM19和LM20抗体）、细菌活死染色以及扫描电镜等，系统阐明了SyPG1/SyPG2在维持共生体功能中的作用。

nPME定位于共生体空间

研究团队首先关注到一种根瘤特异性果胶甲酯酶(nodule PME, nPME)，该酶在根瘤中高表达，特别是在侵染区。果胶甲酯酶(PME)负责催化同型半乳糖醛酸聚糖(HG)的去甲酯化，产生去酯化果胶，这是多聚半乳糖醛酸酶(PG)和果胶酸裂解酶(PL)等果胶降解酶的作用底物。通过亚细胞定位分析，研究人员发现nPME-GFP融合蛋白特异性地富集于蒺藜苜蓿根瘤共生体空间中，而在细胞周边和侵染线(IT)中未检测到信号。这表明共生体空间内持续进行着活跃的果胶去酯化过程，为后续果胶降解奠定了基础。

根瘤菌诱导的共生PGs积累于共生体空间

此前研究表明，根瘤果胶酸裂解酶(NPL)定位于侵染线周围和感染滴，而非共生体周围。因此，研究团队将目光转向了另一类果胶降解酶——多聚半乳糖醛酸酶(PG)。通过对蒺藜苜蓿基因组中80个PG基因的表达谱进行分析，筛选出6个在根瘤中高表达的候选基因。其中，两个依赖于关键转录因子EFD（调控根瘤菌释放和分化）的PG基因——Medtr2g032710和Medtr6g028080被命名为Symbiotic PG1 (SyPG1)和SyPG2。

启动子活性分析和原位杂交结果显示，SyPG1和SyPG2在根瘤原基和成熟根瘤的根瘤间隔区(interzone)表达。更重要的是，通过表达SyPG1/2-GFP融合蛋白，研究人员发现这两个蛋白均特异性地定位于根瘤间隔区侵染细胞的共生体空间，其定位模式与nPME相似。这一结果强有力地支持了共生体空间内存在主动清除果胶机制的假说。有趣的是，SyPG1还定位于根瘤侵染线和感染滴，暗示其可能在这些结构的功能中也发挥作用。

敲低SyPG1/2表达导致根瘤早衰

为了验证SyPG1/2的功能，研究人员构建了同时靶向SyPG1和SyPG2的RNA干扰(RNAi)载体。在转基因毛状根中，SyPG1和SyPG2的转录本水平显著降低。表型分析发现，虽然SyPG1/2敲低植株的结瘤数量和侵染线形态与对照相比无显著差异，但其根瘤的固氮区显著缩小，而衰老区则明显扩大。利用CRISPR-Cas9技术敲除SyPG1/2基因也获得了相似的表型，这从遗传学上证实了SyPG1/2对于维持共生体活性至关重要。

去酯化果胶在SyPG1/2-RNAi根瘤的共生体周围富集

那么，SyPG1/2功能缺失是否真的导致共生体空间中果胶积累？利用识别去酯化果胶的LM19抗体进行免疫荧光染色，发现在对照根瘤的共生体空间中几乎检测不到LM19信号，而在SyPG1/2敲低根瘤的侵染细胞内，去酯化果胶显著积累。免疫电镜分析进一步在超微结构水平证实，SyPG1/2敲低根瘤的共生体空间中存在大量的免疫金颗粒标记，而对照中几乎没有。相反，识别酯化果胶的LM20抗体信号在两组间无显著差异。这些数据明确表明，SyPG1/2的功能是持续清除共生体空间中的去酯化果胶。

去酯化果胶抑制根瘤菌生长

去酯化果胶的积累为何会导致根瘤功能受损？研究人员探讨了果胶对根瘤菌的直接影响。体外实验表明，多聚半乳糖醛酸(PGA，一种去酯化果胶)显著抑制了茎瘤固氮根瘤菌(Sinorhizobium meliloti 2011)的生长，且这种抑制效应具有浓度依赖性。活死染色和扫描电镜结果显示，PGA处理会破坏根瘤菌的细胞完整性，导致细胞死亡。而半乳糖醛酸二聚体(GalA2，PG降解PGA可能产生的短链寡聚半乳糖醛酸)则对根瘤菌生长无影响。更重要的是，用PGA处理野生型根瘤切片会显著降低类菌体的活性，而SyPG1/2敲低或敲除根瘤中的类菌体活性本身也已严重受损。这些结果综合表明，去酯化果胶对根瘤菌/类菌体具有直接的毒性效应，清除这些果胶对于维持共生体的固氮功能是必需的。

讨论与结论

本研究揭示了豆科植物根瘤中一个精细的调控机制，以确保共生体这一"固氮工厂"的核心车间保持适宜的环境。研究人员提出了一个工作模型：尽管共生体空间在细菌释放时可能不含细胞壁成分，但宿主侵染细胞可能持续合成并分泌果胶等细胞壁物质到共生体空间。为了抵消这些物质对类菌体的负面影响，植物会主动将nPME、SyPG1和SyPG2分泌到共生体空间。nPME首先将可能存在的酯化果胶去酯化，随后SyPG1和SyPG2将去酯化果胶降解，从而维持一个无果胶的微环境。当SyPG1/2的功能缺失时，去酯化果胶在共生体空间中积累，直接抑制根瘤菌生长，最终导致根瘤早衰和固氮功能丧失。

这项研究不仅阐明了共生体空间维持无细胞壁状态的新机制，而且将细胞壁修饰酶的功能从传统的发育和防御背景拓展到了互利共生领域。研究表明，宿主主动清除共生体空间中的特定分子，是维持高效共生所必需的。该机制可能具有普遍性，因为在其他豆科植物（如大豆、百脉根）的共生体膜蛋白质组中也发现了多种细胞壁修饰酶。未来，探究这些果胶的确切来源、SyPGs如何被靶向到共生体空间，以及侵染线内的细菌如何受到保护，将为了解豆科植物与根瘤菌相互作用的奥秘提供新的视角。