钠离子通过破坏线粒体能量代谢诱发坏死的新型机制研究

《Nature Communications》：Sodium disrupts mitochondrial energy metabolism to execute NECSO

本研究揭示了钠超载诱发坏死（NECSO）的新机制。研究人员发现TRPM4通道激活介导的钠内流，通过线粒体钠钙交换体（NCLX）破坏线粒体离子稳态，抑制三羧酸循环和氧化磷酸化，导致能量耗竭，进而使Na+/K+-ATPase失活，最终引发细胞肿胀和裂解。该研究为理解钠离子在细胞死亡中的主动调控作用提供了新视角。

　　

在细胞死亡的研究领域，坏死长期以来被视为一种被动的、不受调控的细胞终结方式。然而，近年来研究发现了一些受调控的坏死形式，如坏死性凋亡、焦亡和铁死亡，它们各自拥有独特的分子开关和执行机制。在这些细胞死亡过程中，一个共同的现象是细胞膜完整性最终丧失，导致离子梯度崩溃，特别是钠离子（Na⁺）大量内流，细胞发生肿胀直至破裂。传统观点认为，钠内流仅仅是细胞死亡晚期的一个伴随现象，主要作用是破坏渗透压平衡。但一个关键问题悬而未决：钠内流是否可能不仅仅是细胞死亡的结果，而是主动启动细胞死亡程序的"始作俑者"？

钠离子是细胞外液中最丰富的阳离子，维持细胞内外巨大的钠离子浓度梯度对细胞功能至关重要。这一梯度主要由Na⁺/K⁺-ATPase（钠钾泵）消耗ATP来维持。当这一精密调控系统被打破时，细胞内钠离子浓度异常升高，会引发一系列病理变化。研究人员此前发现了一种由钠超载诱发的特殊坏死形式——NECSO（Necrosis induced by Sodium Overload）。这种细胞死亡由TRPM4（Transient Receptor Potential Melastatin 4）通道的持续性激活触发，导致大量钠离子内流，且不依赖于已知的细胞死亡通路。但是，钠离子究竟如何执行细胞死亡程序，其具体分子机制尚不明确。

在这项发表于《Nature Communications》的研究中，乔宇辉、王江黄等研究人员深入探究了钠超载诱发细胞死亡的精细机制。他们发现，钠离子并非传统认为的仅仅是渗透压的"破坏者"，而是主动"攻击"细胞能量工厂——线粒体的"元凶"。这一发现颠覆了我们对钠离子在细胞死亡中作用的传统认知。

研究人员运用了多种先进技术手段开展此项研究。他们通过电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）精确测量细胞内钠离子浓度变化；利用Seahorse能量分析系统实时监测细胞耗氧率（OCR）和ATP生成速率；采用透射电子显微镜观察线粒体超微结构改变；通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）进行靶向代谢组学分析；使用基因编码的钙离子探针mito-R-GECO1和膜电位染料TMRE等实时监测线粒体离子动态；并借助CRISPR/Cas9基因编辑技术构建TRPM4基因敲除细胞系，验证特定分子的功能。

钠超载触发能量耗竭和线粒体离子失衡先于细胞破裂

研究团队首先使用化学激动剂NC1（Necrocide 1）特异性激活TRPM4通道，发现钠内流是NC1处理的早期事件。有趣的是，在细胞膜破裂之前，细胞内ATP水平已经显著下降，提示能量耗竭可能先于膜完整性丧失。当研究人员在无钠培养基中处理细胞时，NC1不再引起ATP下降和细胞死亡，证实钠内流是这一过程的关键。进一步实验表明，NC1处理导致线粒体肿胀、膜电位崩溃，且这些变化都依赖于钠内流。更重要的是，研究人员观察到线粒体内钠离子浓度（[Na⁺]_mito）升高，而钙离子浓度（[Ca²⁺]_mito）下降，这种离子失衡同样是钠依赖性的。

NECSO中线粒体呼吸受抑制

通过Seahorse能量代谢分析，研究人员发现NC1处理显著降低了细胞的最大呼吸能力和基础呼吸能力。线粒体膜电位（Ψ_m）也出现进行性崩溃。进一步实验证实，NC1处理抑制了电子传递链（ETC）复合体II的活性。在无细胞系统中，高浓度钠离子可直接抑制分离线粒体中复合体II+III的活性，表明钠离子对线粒体呼吸链有直接抑制作用。当研究人员用半乳糖替代葡萄糖培养细胞（迫使细胞更依赖线粒体氧化磷酸化供能）时，细胞对NC1诱导的死亡更加敏感，进一步证实线粒体能量代谢抑制在NECSO中的核心作用。

NECSO中TCA循环受抑制

代谢组学分析揭示了一个重要现象：NC1处理导致三羧酸循环（TCA循环）中间产物（如异柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、富马酸和苹果酸）的积累，表明TCA循环流动受阻。特别值得注意的是，琥珀酸/富马酸比值随时间推移逐渐增加，这与复合体II（琥珀酸脱氢酶，SDH）活性下降的发现一致。同时，丙酮酸脱氢酶复合体（PDHc）的活性形式（非磷酸化状态）减少，而抑制形式（磷酸化PDHA1）增加，进一步证实了丙酮酸代谢障碍。研究人员认为，线粒体钙离子下降可能是TCA循环受抑制的重要原因，因为钙离子是激活多个TCA循环关键酶（PDH、IDH、AKGDH）的重要调节因子。

钠超载诱导的线粒体功能障碍依赖于线粒体NCLX

NCLX（线粒体钠钙交换体）是介导钠离子进入线粒体的关键通道。当研究人员使用特异性NCLX抑制剂CGP37157时，NC1诱导的线粒体肿胀、离子失衡（[Na⁺]_mito升高和[Ca²⁺]_mito下降）、膜电位崩溃、呼吸抑制、TCA循环代谢物积累等现象均得到显著缓解。更重要的是，抑制NCLX可恢复ATP生成并减轻细胞死亡。这些结果明确表明NCLX在介导钠超载诱导线粒体损伤中的核心地位。

细胞能量耗竭通过抑制Na⁺/K⁺-ATPase加剧单价阳离子梯度崩溃

Na⁺/K⁺-ATPase是维持钠钾梯度的重要泵，其正常运作需要消耗大量ATP。研究人员发现，NC1处理早期即可抑制Na⁺/K⁺-ATPase活性，且这种抑制是钠依赖性的。使用低浓度乌本苷（ouabain，Na⁺/K⁺-ATPase抑制剂）可加剧NC1诱导的离子失衡和细胞死亡，表明Na⁺/K⁺-ATPase功能受损在NECSO执行中起关键作用。

TRPM4是NECSO中线粒体功能障碍和能量耗竭所必需的

为了确认NC1的作用是通过TRPM4介导的钠内流而非直接作用于线粒体，研究人员在TRPM4基因敲除细胞中进行了实验。结果显示，在TRPM4缺失的细胞中，NC1不再引起线粒体形态改变、离子失衡、膜电位崩溃、呼吸抑制、ATP下降或Na⁺/K⁺-ATPase活性降低。这些结果强有力地证明，TRPM4介导的钠内流是启动整个死亡信号级联反应的上游事件。

渗透保护剂和AQP4抑制抑制NECSO

在死亡执行阶段，离子梯度崩溃导致渗透压升高，引起水内流和细胞肿胀。研究人员发现，不同分子大小的渗透保护剂对NECSO的保护作用呈尺寸依赖性，分子较大的PEG-8K（水合直径约4 nm）几乎完全抑制细胞死亡，表明细胞膜上形成了纳米级的缺陷。有趣的是，水通道蛋白4（AQP4）的抑制剂或基因敲减也能显著减轻NECSO，提示AQP4可能参与介导了死亡过程中的水内流。

综合所有实验结果，研究人员提出了NECSO的完整分子通路：NC1激活TRPM4通道，引起钠内流；增高的胞质钠通过NCLX进入线粒体，同时排出钙离子；线粒体钠升高直接抑制电子传递链复合体II+III活性，而钙下降则抑制TCA循环关键酶活性；两者共同导致氧化磷酸化障碍和ATP生成减少；能量耗竭使Na⁺/K⁺-ATPase功能受损，进一步加剧钠钾梯度崩溃；渗透压失衡引起水内流（可能由AQP4介导），细胞肿胀最终破裂。

这项研究的创新性在于揭示了钠离子在细胞死亡中的主动调控角色，而不仅仅是被动的渗透压调节因子。它阐明了TRPM4-NCLX轴在连接胞质钠超载与线粒体能量代谢障碍中的核心作用，为理解多种病理条件下（如缺血、高渗应激、器官衰竭等）的细胞死亡机制提供了新框架。这一发现不仅深化了对细胞死亡基本生物学的理解，也为相关疾病的治疗策略开发提供了新的潜在靶点。