靶向CRISPR-Cas9筛选鉴定调控小鼠造血-内皮命运定向的核心转录因子

《Nature Communications》：Targeted CRISPR-Cas9 screening identifies core transcription factors controlling murine haemato-endothelial fate commitment

本研究针对造血-内皮祖细胞（HEM）命运定向的调控机制这一关键科学问题，通过在小鼠胚胎干细胞分化模型中开展靶向转录因子和染色质调控因子的CRISPR-Cas9筛选，鉴定出Etv2、Smad1、Ldb1、Six4等核心驱动因子和Zbtb7b这一抑制因子，揭示了它们在调控中胚层亚群异质性和谱系分化偏向中的关键作用，为造血干细胞应用研究提供了新见解。

　　

生命是如何从一团看似相同的细胞中，精确地分化出血液、血管、肌肉等不同组织和器官的？这是发育生物学领域的核心问题之一。在哺乳动物胚胎发育早期，血细胞的生成始于卵黄囊，由一个兼具造血和内皮潜能的特殊前体细胞——造血-内皮中胚层（Haemato-endothelial Mesoderm, HEM）分化而来。理解这一过程的分子调控机制，不仅对于揭示生命起源奥秘至关重要，也为利用多能干细胞在体外生成功能性造血干细胞用于再生医学提供了理论基础和应用前景。

尽管研究已知一些关键转录因子，如Etv2，在HEM特化中扮演着“主调控因子”的角色，但关于初始的多能中胚层（primitive Mesoderm, priMes）是如何精确过渡到HEM，以及其中涉及的完整调控网络，仍然是该领域亟待解决的重要问题。为了解决这个问题，由Nina Schmolka领导的研究团队在《Nature Communications》上发表了他们的最新研究成果。

研究者们巧妙地结合了小鼠胚胎干细胞（Embryonic Stem Cell, ESC）体外分化模型和大规模的靶向CRISPR-Cas9基因敲除筛选技术。他们首先对一个包含4077个转录因子和染色质调控因子基因的sgRNA文库进行筛选，通过在能重演胚胎血液发育的ESC分化体系中追踪不同中胚层群体（通过表面标志物FLK1和PDGFRα区分）中sgRNA的丰度变化，来寻找调控从双阳性原始中胚层（DP priMes）向FLK1单阳性HEM（F_SP HEM）转变的关键基因。

关键技术方法概述

本研究的关键技术包括：利用组成性表达Cas9的小鼠胚胎干细胞系构建体外胚状体分化模型，模拟中胚层发育和早期造血过程；针对4077个基因的靶向CRISPR-Cas9筛选库进行三次独立的筛选，并通过MAGeCK分析筛选结果；利用流式细胞术分选不同发育阶段的细胞群体（如DN、P_SP、DP priMes、F_SP HEM）；进行体外造血内皮祖细胞培养、长期造血功能检测以及高维流式细胞分析以评估细胞分化潜能；并综合运用批量RNA测序、单细胞RNA测序（包括SORT-seq和10x Chromium固定RNA分析）进行转录组表征和细胞轨迹推断。

深入表征发育路径并验证模型系统

研究团队首先对他们的ESC分化模型进行了深入的表型和分子表征，证实了利用FLK1和PDGFRα表达可以区分不同的中胚层群体，并且这些群体在发育轨迹和功能上存在显著差异。单细胞RNA测序分析构建了从DN→P_SP→DP priMes→F_SP HEM的发育路径，并与体内发育数据具有高度相似性。功能实验表明，F_SP HEM相比DP priMes具有更强的生成造血和内皮细胞的潜能，证明了该模型能忠实再现早期中胚层定向和后续的血液分化。

CRISPR筛选鉴定HEM定向的核心转录因子

通过比较F_SP HEM和DP priMes群体中sgRNA的丰度，研究人员鉴定出在HEM定向中可能起驱动作用（sgRNA富集）或抑制作用（sgRNA缺失）的候选基因。经过三轮独立筛选的数据整合和严格筛选，他们最终确定了10个在HEM定向中可能起关键促进作用的基因（包括已知的Etv2）和4个可能起抑制作用的基因。

验证促进或抑制HEM定向的关键基因

研究团队为候选基因构建了独立的敲除ESC系，并通过体外分化实验进行验证。他们成功验证了四个驱动HEM分化的转录因子：Smad1、Etv2、Ldb1和Six4。这些基因的敲除导致F_SP HEM细胞比例显著下降，但总FLK1⁺细胞数量未受影响，表明它们特异性地调控了从DP priMes向F_SP HEM的转变，而非一般性的中胚层定向。同时，他们验证了Zbtb7b作为HEM分化的抑制因子，其敲除导致F_SP HEM比例增加。单细胞基因表达分析显示，除Etv2外，其他候选基因在DP priMes和F_SP HEM群体中的表达水平相似，凸显了CRISPR筛选在发现这类调控因子方面的优势。

核心TF差异性调控造血和内皮谱系定向

为了解这些核心转录因子如何影响后续谱系分化，研究人员将各敲除系的总FLK1⁺细胞分选出来，并进行定向分化，利用高维流式细胞术分析其谱系输出。结果发现，不同转录因子敲除导致中胚层细胞表现出截然不同的谱系分化偏向：Etv2和Ldb1敲除完全阻断了造血和内皮分化；Six4敲除主要影响内皮谱系（尤其是内皮1型细胞）的形成，但保留了一定的造血分化能力；Smad1敲除严重削弱但未完全阻断造血/内皮分化；而Zbtb7b敲除则增强了向造血谱系和内皮2型细胞的分化。这表明每个转录因子在谱系特化中扮演着独特角色。

核心TF调控中胚层细胞的异质性

为了在更高分辨率下解析敲除引起的转录组变化和细胞异质性，研究团队对对照和各敲除系的总FLK1⁺细胞进行了10x Chromium单细胞RNA测序分析。他们鉴定出10个具有连续发育关系的细胞簇，并将其划分为从原始中胚层（C1, priMes1）到高度定向的HEM（C6, HEM2）的发育轨迹。不同敲除系呈现出独特的细胞簇组成：Etv2和Ldb1敲除细胞发育停滞在早期阶段；Six4敲除细胞仍能形成所有簇，但比例改变，且能形成最成熟的C6簇，这与它能形成部分造血细胞的结果一致；Smad1敲除细胞则走向了一条异常发育路径，出现了神经外胚层（C7）、混合中胚层（C8）和早期内皮祖细胞（C9）等特有簇；Zbtb7b敲除细胞中，表征血液发育定向的C5（HEM1）簇比例增加，而高表达Foxf1（一个已知的造血抑制因子）的C3簇比例减少，这解释了其增强的HEM分化潜能。伪时间轨迹分析进一步支持了这些发现。

研究结论与意义

这项研究通过大规模CRISPR筛选，不仅确认了Etv2作为HEM定向的关键调控因子，还鉴定出Smad1、Ldb1、Six4等新的驱动因子和Zbtb7b这一抑制因子。研究发现，这些因子缺失会导致中胚层细胞产生不同的谱系分化偏向，揭示了中胚层发育过程中存在此前未被充分认识的细胞异质性和复杂的调控网络。该研究填补了我们对早期造血命运决定分子机制理解上的空白，其发现的核心调控因子为优化体外造血干细胞诱导分化方案提供了新的靶点和思路，有望推动基于干细胞的血液疾病治疗研究的发展。同时，研究也提示，未来需要更精细的细胞表面标志物来区分中胚层亚群，并需在体内模型中进一步验证这些因子的功能。