基于多酶级联与辅因子再生系统的2'-岩藻糖基乳糖体外合成新策略

《Scientific Reports》：Synthesis of 2′-fucosyllactose using multi-enzyme cascade with cofactor regeneration

本研究针对2'-岩藻糖基乳糖(2'-FL)合成过程中GTP依赖性强、成本高的技术瓶颈，设计了一种以甘露糖和乳糖为底物的体外多酶级联合成体系。研究人员通过引入工程化多磷酸依赖型葡萄糖甘露糖激酶(PPGMK)实现高效磷酸化，并筛选出关键限速酶GDP-D-甘露糖-4,6-脱水酶(gmd)，同时建立基于多磷酸激酶2(PPK2)的GTP再生系统。最终在优化条件下实现13.18 mM的2'-FL产量，辅因子消耗降低6.6倍，为母乳寡糖的绿色制造提供了新范式。

　　

在婴幼儿营养领域，2'-岩藻糖基乳糖(2'-FL)作为人类母乳中含量最丰富的寡糖之一，被誉为“黄金营养素”。其独特的生理功能包括调节肠道菌群、促进大脑发育和增强抗感染能力，已获得美国FDA批准用于婴幼儿配方奶粉。然而，传统的微生物发酵法存在代谢旁路干扰、副产物积累和纯化成本高等痛点，而化学合成路线又面临步骤繁琐、保护基操作复杂等挑战。面对这些技术瓶颈，北京化工大学的曹晨曦、白怡等研究团队在《Scientific Reports》发表了一项突破性研究，开创性地构建了基于多酶级联与辅因子再生系统的体外合成新策略。

研究团队采用模块化酶工程思路，将天然代谢途径重构为体外高效反应体系。关键技术包括：1)利用工程化多磷酸依赖型葡萄糖甘露糖激酶(PPGMK)实现甘露糖磷酸化；2)筛选来自不同物种的磷酸甘露糖变位酶(manB)、甘露糖-1-磷酸鸟苷酰转移酶(manC)等关键酶；3)建立多磷酸激酶2(PPK2)介导的GTP再生系统与异柠檬酸脱氢酶(Icd)参与的NADPH再生系统。

优化级联系统

通过系统优化反应条件，发现Mg²⁺在25 mM浓度时使2'-FL产量提升6.19倍，pH 7.5为最适反应环境。酶浓度梯度实验揭示GDP-D-甘露糖-4,6-脱水酶(gmd)与α-1,2-岩藻糖基转移酶(FucT)共同构成合成路径的关键限速步骤。当gmd浓度从20 μM降至2 μM时，产量骤减90%，证实其受产物GDP-L-岩藻糖的反馒抑制且稳定性较差。

GTP再生系统开发

在四种测试的多磷酸激酶2(PPK2)中，来自弗朗西斯菌(PPK-Ft)和铜绿假单胞菌(PPK-Pa)的酶表现出优异性能，使2'-FL产量提升约2.9倍。相较于葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)，异柠檬酸脱氢酶(Icd)介导的NADPH再生系统更高效。双辅因子再生系统的建立，使得GTP和NADPH添加量从10 mM降至2 mM，但产量反而提升至6.12 mM，显著降低生产成本。

体外一锅法合成2'-FL

最终建立的优化体系在48小时内将20 mM甘露糖转化为13.18 mM 2'-FL，转化率达65.9%。该产量显著高于已报道的补救合成路线（4.3 mM），且避免了L-岩藻糖昂贵底物的使用。

本研究首次在学术层面证实了以甘露糖为起点的体外从头合成2'-FL的可行性。通过工程化PPGMK实现高效磷酸化、识别gmd为关键限速酶、构建经济高效的辅因子再生系统三大创新点，为母乳寡糖的绿色生物制造提供了新思路。该技术路线具有环境友好、产物易纯化、避免代谢旁路等优势，不仅为体外酶法合成提供了模板，也为体内代谢工程改造提供了酶元件选择与路径优化的重要参考。随着酶稳定性与催化效率的进一步提升，这项研究有望推动2'-FL生产工艺向更经济、可持续的方向发展。