手动离心式微流控LAMP平台：水上运动中水生病原体快速可视化检测的新策略

《Scientific Reports》：A manually driven centrifugal microfluidic LAMP platform for rapid visual detection of waterborne pathogens in aquatic sports

本研究针对水上运动日益严峻的水源性疾病风险，开发了一种集成化现场检测(POCT)平台。研究人员通过结合无仪器核酸提取、手动离心微流控芯片和可视化环介导等温扩增(LAMP)技术，实现了对金黄色葡萄球菌(S. aureus)等五种水生病原体的快速检测。该平台在60分钟内完成"样本到结果"检测，灵敏度达10-100拷贝/反应，特别在低浓度样本中展现出优于传统管式反应的稳定性。这项研究为资源有限环境下的可靠POCT系统提供了创新解决方案，验证了"后端补偿"的设计理念。

　　

随着皮划艇、公开水域游泳、铁人三项等水上运动的全球性热潮，运动员和爱好者们与自然水体的亲密接触也带来了前所未有的公共卫生挑战。流行病学研究已经明确证实，娱乐性水体暴露与胃肠道、呼吸道和皮肤感染发病率增加存在显著关联。然而，传统的病原体检测方法却难以满足动态现场环境的迫切需求——微生物培养需要24-72小时，免疫学方法依赖精密仪器且灵敏度不足，而经典的聚合酶链式反应(PCR)虽然灵敏特异，却需要热循环仪、稳定电力支持和专业操作人员，在资源有限的现场环境中显得力不从心。

面对这一技术瓶颈，由YanJing Chen、LinXiao Wu等研究人员在《Scientific Reports》上发表的最新研究，提出了一种创新性的解决方案：一种手动驱动的离心式微流控LAMP平台，专门用于水上运动中水生病原体的快速可视化检测。这项研究不仅技术上具有突破性，更提出了一种名为"后端补偿"的设计哲学，为现场分子诊断技术的发展提供了新思路。

研究人员采用了多项关键技术方法开展本研究。他们首先设计了针对五种病原体特异性基因的LAMP引物，并优化了可视化检测系统；开发了聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)微流控芯片，通过手动离心实现样本均匀分配；建立了无仪器的注射器式核酸提取方法；最后通过模拟污染水样验证了整个集成系统的性能。

Development of a visualized LAMP detection system

研究人员首先建立了可视化LAMP检测系统。通过系统优化，他们发现含有50 mM酚红和16 mM亚甲蓝的复合染料在pH 8.4±0.05的缓冲液中能产生从紫色到绿色的明显颜色变化，最佳工作浓度为0.4 mM。引物性能验证显示，该系统的检测限(LOD)与实时荧光法相当，其中志贺氏菌(S. flexneri)、沙门氏菌(S. Typhimurium)、铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)和产肠毒素大肠杆菌(E. coli)的LOD为10拷贝/反应，金黄色葡萄球菌(S. aureus)为100拷贝/反应，且具有高度特异性。

Design, Manufacturing, and Verification of Fluid Functionality in Manual Centrifugal Microfluidic Chips

研究团队设计并制造了扇形离心式微流控芯片，厚度3毫米，包含11个平行反应腔，每个腔室最大容量5μL。功能验证表明，该芯片能够通过手动离心实现液体均匀分布，在65°C水浴孵育50分钟后仍保持良好的热稳定性和密封完整性，无液体蒸发或泄漏现象。

Construction and Performance Evaluation of a Multitarget Visualization LAMP Detection Platform on a Chip

在芯片平台上，研究人员采用5% PEG8000和5%海藻糖的固定溶液预埋引物，建立了多靶点可视化LAMP检测平台。性能评估显示，芯片平台的LOD与管式反应相当，且具有高度特异性，仅在样本DNA与预埋引物对应时出现阳性颜色变化。

Assessment of a Simplified Nucleic Acid Extraction Technique

核酸提取方法评估表明，注射器式提取装置整个流程不超过10分钟，但对不同细菌类型的提取效率存在差异。对革兰氏阴性菌(如志贺氏菌)，其提取效率与商业试剂盒相当，芯片可视化检测的LOD达到1×10¹CFU/mL；而对革兰氏阳性菌(如金黄色葡萄球菌)，提取效率较低，LOD仅为1×10³CFU/mL。

Comprehensive Process Performance Verification in Simulated Contaminated Water Samples

最终，研究团队使用模拟污染水样进行了全流程验证。将沙门氏菌和铜绿假单胞菌加入过滤湖水中，浓度为1×10⁰CFU/mL，通过注射器装置快速提取核酸后，在微流控芯片上进行可视化LAMP检测。结果显示，两个模拟水样均在芯片上特定的靶标通道显示出明显的阳性颜色变化，而阴性对照和其他非靶标通道保持不变，表明复杂的水样基质不会显著影响该集成系统的检测性能和特异性。

这项研究的结论部分强调了几个重要发现。首先，该平台成功将无仪器核酸提取与手动离心微流控技术相结合，虽然提取和检测模块在物理上是分离的，但构成了功能集成的检测流程，整个"样本到结果"过程可在约60分钟内完成，且无需外部电源。

其次，研究揭示了简化核酸提取方法在不同细菌类型中的效率差异，这对明确当前方法的适用性和局限性具有重要意义。尤为值得注意的是，在所有测试中，芯片平台相比传统管式反应显示出更高的检测灵敏度和稳定性，特别是在分析低浓度样本时。这一优势可归因于两个因素：使用的DNA模板总量更大，以及微尺度反应系统提供的改善的均匀性和减少的随机抑制效应。

这一发现表明，精心构建的检测平台不仅能在最佳条件下提高检测限，还能在关键浓度下增强系统的稳健性，有助于弥补前端样品处理效率的不足。这种"后端补偿"的设计理念可能对推进可靠的POCT应用具有广泛意义，特别是在复杂的现实场景中。

当然，研究也存在一些局限性，如验证的病原体种类有限、使用的是模拟污染水样、当前视觉读out主要是定性的等。未来的研究需要扩大目标范围，在更广泛的真实水基质中验证平台的稳健性，并开发半定量方法。

总体而言，这项研究建立了一个功能验证平台，为未来快速诊断系统的设计和优化提供了实用见解。它强调了一种对POCT应用可能有价值的设计理念：精心构建的后端检测平台不仅作为信号读取器，还能作为功能模块提升整体系统性能和稳健性，帮助抵消简化前端样品处理阶段可能出现的常见效率损失或随机波动。这一创新思路为水上运动安全监测提供了可行的技术解决方案，也为资源有限环境下的分子诊断技术发展指明了新方向。