永生化人淋巴管内皮细胞的深度表征：转录组谱与VEGFC应答研究及其在淋巴疾病建模中的应用

《Scientific Reports》：Further characterisation of immortalised human lymphatic endothelial cells to explore their transcriptomic profile and VEGFC response

本研究针对原发性淋巴管畸形（PLA）研究中缺乏稳定、可长期传代的淋巴管内皮细胞（LEC）模型的问题，对一种新型永生化LEC（imLEC）进行了系统性表征。研究证实imLEC能长期维持关键淋巴标记物（如EPHB4、FOXC2、ERG）的表达，逃避复制性衰老，并对VEGFC刺激表现出与原发性LEC（HDLEC）相似的增殖、迁移及出芽反应。尽管转录组分析揭示部分基因（如FLT4、PROX1）表达存在差异，但imLEC仍展现出作为PLA相关基因变异功能研究和基因编辑（如CRISPR/Cas9）应用的巨大潜力，为淋巴研究提供了可重复性高、寿命长的细胞工具。

　　

在生命科学和医学研究领域，科学家们常常依赖于体外培养的细胞来模拟人体内的生理和病理过程。对于淋巴系统相关疾病，特别是原发性淋巴管畸形（Primary Lymphatic Anomalies, PLA）的研究而言，人类真皮淋巴管内皮细胞（Human Dermal Lymphatic Endothelial Cells, HDLECs）长期以来被视为“金标准”模型。然而，这些源自单一供体的原代细胞存在一个致命的弱点：它们在实验室培养皿中经过几次传代后，就会逐渐“衰老”，失去其典型的淋巴管特征和增殖能力。更棘手的是，不同批次的细胞之间存在差异，给实验结果的稳定性和可重复性带来了巨大挑战。尤其是在利用CRISPR/Cas9等前沿基因编辑技术研究疾病相关基因变异时，需要经过漫长的筛选和扩增过程，原代细胞的短寿命成为了难以逾越的障碍。

为了解决这一瓶颈问题，研究人员开始尝试创建“永生化的”细胞系。最近，Frenkel等人通过联合引入人类端粒酶逆转录酶（hTERT）和GFP标记的BMI-1基因，成功地将人真皮微血管内皮细胞转化成了具有长期增殖能力的永生化淋巴管内皮细胞（immortalized LECs, imLECs），并初步证实其能维持基本的淋巴管形态和标记物表达。但这仅仅是个开始，这种新型的imLEC能否真正替代HDLEC，成为研究淋巴管生物学和PLA疾病的可靠模型？它们对关键的淋巴管生长因子VEGFC（Vascular Endothelial Growth Factor C）是否依然保持功能性应答？其内在的基因表达谱与HDLEC相比又有何异同？这些问题都需要更深入、更全面的评估。

为了回答这些问题，由Kazim Ogmen、Ruby Moy、Sara E. Dobbins等研究人员组成的研究团队在《Scientific Reports》上发表了他们的最新研究成果。他们旨在对imLEC进行进一步的系统表征，从蛋白表达、细胞衰老、转录组特征到VEGFC驱动的功能性反应等多个维度，将其与商业购买的HDLEC进行详细比较，以评估imLEC作为体外研究模型的适用性和局限性。

为了开展这项研究，作者团队运用了多种关键技术方法。研究使用的细胞模型包括商业来源的原代人真皮淋巴管内皮细胞（HDLECs，来自PromoCell公司，源自不同未成年供体）和已发表的永生化淋巴管内皮细胞（imLECs）。核心技术手段涵盖：免疫荧光和流式细胞术用于检测淋巴标记物（如CD31、PROX1、VE-Cadherin、EPHB4、FOXC2、ERG）的表达和定位；蛋白质印迹（Western Blot）用于分析衰老相关蛋白（p16^INK4a, p21^cip1/waf1）的表达；RNA测序（RNA-seq）及生物信息学分析（包括主成分分析PCA、差异表达基因分析DESeq2、基因集富集分析GSEA）用于比较转录组谱；基于Livecyte系统的无标记活细胞成像用于定量单细胞增殖和迁移；以及3D球体出芽实验用于评估淋巴管生成能力。

结果与讨论

imLECs retain long-term expression of lymphatic endothelial markers including the PLA-associated proteins EPHB4, FOXC2 and ERG without reaching replicative senescence

研究人员首先确认了imLECs能长期稳定地表达淋巴管内皮细胞的关键标志物。免疫荧光染色显示，imLECs在早期和晚期传代中都能持续表达膜蛋白VE-Cadherin和核蛋白PROX1，而HDLECs在晚期传代时这两种蛋白的表达均显著下降，提示其身份丢失。更重要的是，研究人员检测了三种与PLA相关的蛋白——EPHB4、FOXC2和ERG。结果表明，imLECs在不同传代次数下，这些蛋白的表达水平和亚细胞定位均与HDLECs相似，没有明显差异，仅FOXC2在晚期HDLECs中的阳性细胞百分比有所减少。这表明imLECs能够长期维持其淋巴管身份特征。

接下来，研究团队探究了细胞的衰老情况。衰老细胞的一个典型特征是出现多核。量化分析发现，随着传代，HDLECs的多核细胞数量增加了32%，而imLECs在培养超过五个月（传代39次）后，多核细胞数量没有显著变化。在分子水平上，Western Blot结果显示，晚期HDLECs中衰老相关蛋白p16的表达增加了70%，而在imLECs的所有传代中几乎检测不到p16。另一个细胞周期调控蛋白p21在两种细胞中均有表达，这可能与其在控制内皮细胞生理性增殖中的作用有关。这些结果共同表明，imLECs具有逃避复制性衰老的能力，适合进行需要长期培养的实验。

RNA-sequencing shows a high level of correlation but slightly different PLA-associated gene transcription signatures in imLEC and HDLECs.

为了在基因组层面深入比较两种细胞，研究人员进行了RNA测序。主成分分析（PCA）显示，HDLECs样本聚集在一起，而imLECs则根据传代早晚分为两个簇。尽管Spearman相关性分析显示所有样本的整体基因表达具有高度相关性（相关系数=0.99），但更精细的差异表达基因分析（DESeq2）揭示了一些关键区别。

与早期HDLECs相比，早期imLECs中有4.74%的基因显著上调，3.07%的基因显著下调。在关注的45个与淋巴管发育、功能或PLA相关的基因中，大部分（41个）没有差异，但发现FLT4（编码VEGFR3）、PROX1、ADAMTS3和SOX18的表达在imLECs中显著下调。这一发现通过RT-qPCR得到了验证。当比较晚期imLECs与早期HDLECs时，也观察到了类似的趋势，并且还发现了GJA1和CCBE1的下调，以及ITGA9、FAT4和SHANK3的上调。

基因集富集分析（GSEA）进一步揭示了imLECs中显著富集的信号通路。在早期和晚期imLECs中，都与细胞外基质（ECM）组织、降解以及胶原代谢相关的通路高度相关，提示细胞与周围环境的相互作用活跃。此外，在晚期imLECs中还富集了与轴突导向等神经元相关的通路，这可能反映了内皮细胞和神经元在出芽机制上的共性。特别值得注意的是，与早期imLECs相比，晚期imLECs显示出上皮-间质转化（EMT）和TNFα信号通路的富集，暗示长期培养可能引起细胞状态的细微漂移。然而，关键淋巴管标记物如FLT4和PROX1在imLECs的不同传代间表达稳定，说明其核心身份得以维持。

VEGFC induces proliferative and migratory responses in imLECs in both 2D and 3D-cellular assays

VEGFC通过其受体VEGFR3介导的信号通路是驱动淋巴管生成（lymphangiogenesis）的核心。尽管RNA-seq发现imLECs的FLT4（VEGFR3）表达低于HDLECs，但流式细胞术证实了超过83%的晚期imLECs细胞表面存在VEGFR3蛋白，表明其具有功能性的受体。那么，imLECs对VEGFC的刺激是否会产生功能性应答？

研究人员利用高内涵活细胞成像系统（Livecyte）进行了精确的定量分析。在增殖方面，用100 ng/mL VEGFC刺激48小时后，晚期imLECs的细胞数量增加，其反应程度与早期HDLECs相当。而晚期HDLECs则几乎对VEGFC没有增殖反应，这与它们的衰老状态相符。一个有趣的现象是，imLECs在基础条件下（无VEGFC刺激）也表现出较高的增殖活性，但在VEGFC刺激下，其增殖在18小时和24小时仍能显著增强。

在细胞迁移方面，VEGFC刺激显著增加了HDLECs和imLECs（无论早晚传代）的累积迁移距离和移动速度，且两种细胞类型对VEGFC的迁移反应模式相似。

最后，在更接近体内环境的3D球体出芽实验中，VEGFC同样能显著促进imLECs（早晚传代）和早期HDLECs的出芽，表现为芽长、出芽数量及球体周长的增加。然而，与HDLECs在基础条件下出芽极少不同，imLECs即使在基础条件下也表现出较强的出芽能力。这可能与imLECs中VEGFR2（KDR）表达上调，使其对培养基中可能存在的其他生长因子（如VEGF165）更敏感有关。尽管如此，VEGFC的刺激依然能显著增强imLECs的出芽能力，且其出芽形态与HDLECs相似。

研究结论与意义

本研究对永生化人淋巴管内皮细胞（imLECs）进行了全面的功能表征，并将其与广泛使用的原代HDLECs进行了系统比较。研究结果表明，imLECs能够长期维持关键淋巴管内皮标记物（包括PLA相关蛋白EPHB4、FOXC2和ERG）的表达，且能有效逃避复制性衰老。在功能上，imLECs对核心淋巴管生长因子VEGFC的刺激表现出与HDLECs相似的增殖、迁移和3D出芽反应。转录组分析虽然揭示了imLECs与HDLECs之间存在一些差异，例如FLT4/VEGFR3表达下调而KDR/VEGFR2表达上调，以及一些ECM和信号通路相关基因的改变，但整体而言，其淋巴管身份和核心功能得以保留。

这项研究的重要意义在于，它有力地支持了imLECs作为一种新型、可靠的工具细胞，可用于淋巴管生物学和疾病机制的研究，特别是应用于需要长期培养和基因操作的场景，如利用CRISPR/Cas9技术构建PLA相关基因变异的疾病模型。虽然需要注意其与原发性细胞在转录组层面的差异，并进行针对性的通路验证，但imLECs的出现为克服原代细胞寿命短、批次差异大等局限性提供了极具前景的解决方案，将有助于推动对原发性淋巴管畸形等疾病更深入、更可重复的科学研究。