光遗传诱导α-突触核蛋白聚集揭示帕金森病早期突触功能障碍

《npj Parkinson's Disease》：Optogenetic-induced α-synuclein accumulation reveals early synaptic dysfunction in experimental models of Parkinson’s disease

本研究针对帕金森病（PD）早期α-突触核蛋白（α-syn）聚集诱导突触功能障碍的机制尚不明确的问题，利用光诱导蛋白聚集（LIPA）系统在体诱导α-syn聚集。研究发现，黑质致密部（SNc）多巴胺能神经元中LIPA-α-syn包涵体的形成可导致纹状体突触前结构改变、多巴胺（DA）稳态失调，并引起D1-MSNs和D2-MSNs活动失衡，这些变化发生于轴突退行性变之前。该研究为理解PD早期突触病变提供了新见解。

　　

帕金森病（Parkinson's disease, PD）是一种常见的神经退行性疾病，其典型的运动症状（如静止性震颤、运动迟缓等）通常出现在疾病的中晚期。然而，越来越多的证据表明，在运动症状出现之前的数年甚至数十年，患者大脑中就已经开始了隐秘的病理变化。其中，神经元突触（synapse）的功能失调被认为是PD早期的一个关键事件。那么，究竟是什么触发了这一早期的突触功能障碍，并最终导致神经细胞死亡呢？科学家们将目光聚焦在了一种名为α-突触核蛋白（alpha-synuclein, α-syn）的蛋白质上。

在健康的大脑中，α-syn主要存在于神经元的突触前终末（presynaptic terminal），参与调节神经递质的释放。然而，在PD患者的大脑中，α-syn会发生错误折叠和异常聚集，形成被称为路易体（Lewy bodies, LBs）的蛋白质团块，这些团块是PD的标志性病理特征。尤其值得注意的是，这些α-syn的聚集体似乎更早地出现在神经纤维的末端（即突触部位），而不是神经元的胞体。这支持了PD病理的“逆行性死亡”（dying-back）假说，即病变可能始于遥远的神经末梢，然后沿着轴突逆向传播，最终导致神经元胞体的死亡。尽管这一假说得到了许多观察结果的支持，但科学家们一直缺乏有效的研究工具来精确地控制α-syn聚集发生的时间和地点，从而难以在活体动物中实时观察和记录由α-syn聚集所触发的最早期事件。传统的研究模型，如过表达α-syn的转基因小鼠或注射α-syn预制纤维（preformed fibrils）模型，往往无法精确控制聚集过程的时间，只能反映疾病晚期的病理变化。

为了突破这一技术瓶颈，由Raquel Rodriguez-Aller、Abid Oueslati和Armen Saghatelyan等科学家领导的研究团队，利用了一项前沿技术——光诱导蛋白聚集（Light-Inducible Protein Aggregation, LIPA）系统。这项巧妙的技术就像给α-syn蛋白安装了一个“光控开关”。研究人员将α-syn与一种对蓝光敏感的蛋白（CRY2）融合在一起。在正常情况下，这种融合蛋白在神经元内是均匀分布的。然而，当用特定波长的蓝光照射时，这些蛋白会迅速聚集在一起，形成类似路易体的包涵体（inclusions）。更重要的是，这个过程是可逆的，且具有极高的时间和空间分辨率，使得研究人员能够在设定的时间点，在大脑的特定区域（如黑质致密部）诱导α-syn的聚集，并实时观察其下游效应。

利用这一强大的工具，研究人员在《npj Parkinson's Disease》上发表的最新研究中，深入探究了α-syn聚集如何破坏大脑中一条至关重要的通路——黑质纹状体通路（nigrostriatal pathway）。这条通路对于运动的精细调控至关重要。它起源于中脑的黑质致密部（Substantia Nigra pars compacta, SNc）的多巴胺能神经元（dopaminergic neurons），这些神经元发出长长的轴突投射到大脑的纹状体（striatum），并在那里释放多巴胺（dopamine, DA）来调节纹状体神经元的活动。纹状体中主要有两种类型的中棘神经元（medium spiny neurons, MSNs）：一种是表达D1多巴胺受体（D1-MSNs）的神经元，它们主导基底神经节的“直接通路”（direct pathway），促进运动；另一种是表达D2多巴胺受体（D2-MSNs）的神经元，它们主导“间接通路”（indirect pathway），抑制不想要的运动。这两条通路活动的精细平衡，是我们能够流畅运动的基础。在PD中，黑质多巴胺能神经元的退化和死亡，破坏了这种平衡，导致运动障碍。本研究旨在揭示α-syn的异常聚集是如何作为“始动因素”，早期破坏纹状体突触功能和神经环路活动的。

为开展此项研究，研究人员综合运用了几项关键实验技术。在体（in vivo）研究中，他们通过立体定位注射（stereotactic injection）将编码LIPA-α-syn的腺相关病毒（AAV）递送到小鼠的黑质致密部，并植入无线光遗传刺激装置。通过微型内窥镜钙成像（mini-endoscopic Ca²⁺imaging）技术，在自由活动的小鼠纹状体记录神经元钙活动。同时，采用免疫组织化学（immunohistochemistry）分析突触标志物和神经元激活情况，并通过高效液相色谱（High-performance liquid chromatography, HPLC）检测纹状体内多巴胺及其代谢物水平。在体外（in vitro）实验中，他们利用人诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cells, hiPSCs）来源的多巴胺能神经元（iDA）模型，结合LIPA系统，在人类细胞中验证α-syn聚集对突触结构的影响。

LIPA-α-syn包涵体在中脑的诱导导致纹状体神经元环路的快速空间重组

研究人员首先想知道，在黑质多巴胺能神经元中诱导α-syn聚集后，会对远端的纹状体神经元活动产生怎样的即时影响。他们在小鼠SNc表达LIPA-α-syn，并在纹状体表达钙指示剂GCaMP6s，然后通过植入的双重光遗传/微型内窥镜套管系统，在给予SNc蓝光刺激（诱导α-syn聚集）的同时，记录自由活动小鼠纹状体神经元的钙离子（Ca²⁺）活动。结果发现，诱导LIPA-α-syn包涵体形成后，纹状体神经元的钙瞬变（Ca²⁺transients）频率和振幅发生了显著改变。具体而言，低、中振幅的钙瞬变减少，而高振幅的钙瞬变反而增加。通过聚类分析（cluster analysis），研究人员将纹状体细胞分为三个功能簇（cluster）。诱导α-syn聚集后，属于簇1（具有较高钙瞬变振幅）的神经元比例显著减少，而属于簇2（具有较低钙瞬变振幅）的神经元比例显著增加。这种神经元活动模式的“重组”在诱导后第2天就已出现，并持续到第10天。有趣的是，尽管纹状体神经环路的这种功能性改变已经发生，小鼠在旷场中的运动行为（移动和静止时间）在此早期阶段并未出现显著异常，这模拟了PD的前驱期（prodromal phase）状态。此外，所有簇的神经元在动物移动时都表现出更高的活动频率，表明它们仍参与运动编码，但α-syn聚集诱导的网络重组改变了不同神经元群体在静息状态下的基础活动水平。

LIPA-α-syn包涵体诱导直接和间接纹状体通路失衡

既然纹状体神经元的活动发生了改变，那么这些变化的细胞基础是什么？纹状体绝大部分神经元是MSNs。研究人员推测，上述聚类分析中的簇1和簇2可能分别对应D1-MSNs和D2-MSNs。为了验证这一假设，他们在诱导SNc的LIPA-α-syn聚集10天后，通过检测神经元激活标志物c-fos的表达，来评估D1-MSNs和D2-MSNs的激活情况。结果非常明确：与对照组相比，LIPA-α-syn聚集导致被激活的D1阳性细胞（c-fos+/D1+）数量显著减少，而被激活的D2阳性细胞（c-fos+/D2+）数量则显著增加。这表明，α-syn包涵体破坏了直接通路和间接通路神经元活动的平衡，即抑制运动的间接通路活动相对增强，而促进运动的直接通路活动相对减弱。这种失衡正是PD运动症状的神经环路基础，而本研究显示它在轴突退化前就已出现。

LIPA-α-syn包涵体在多巴胺能末梢的积累诱导小鼠纹状体突触功能障碍

纹状体神经元活动的改变，其根源很可能在于上游的多巴胺能神经末梢出现了问题。研究人员接下来探究了这种早期功能失衡是否源于多巴胺能轴突的退化。他们检测了纹状体中多巴胺能神经末梢的标志物——酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase, TH）和多巴胺转运体（dopamine transporter, DAT）的纤维密度。结果显示，在诱导α-syn聚集10天后，TH和DAT的纤维密度与对照组相比没有差异，说明此时尚未发生多巴胺能轴突的退行性变。那么，问题出在哪里呢？免疫荧光染色证实，LIPA-α-syn包涵体确实被运输并积累在了纹状体的突触前终末。更重要的是，与突触前标志物突触素（synaptophysin）的共定位分析发现，α-syn的积累导致了突触结构的显著改变：纹状体内synaptophysin阳性的突触膨体（varicosities）数量和表面积都显著增加，同时synaptophysin的整体表达水平也升高了。这些发现表明，α-syn在突触前的积累触发了突触前结构的病理重塑，这种结构改变可能先于轴突退化，并导致功能异常。

黑质LIPA-α-syn包涵体的诱导破坏小鼠纹状体多巴胺稳态

多巴胺能突触的结构改变必然会影响其功能。研究人员进而检测了纹状体内多巴胺神经传递的关键指标。通过HPLC分析，他们发现了一个令人惊讶的现象：在诱导LIPA-α-syn聚集后，纹状体组织中的多巴胺（DA）含量显著升高。然而，多巴胺的主要代谢产物3,4-二羟基苯乙酸（DOPAC）和3-甲氧酪胺（3-MT）的水平却没有发生显著变化。DOPAC/DA比值显著降低，提示多巴胺的周转（turnover）可能受到了影响。这些结果说明，α-syn的聚集并非简单地导致多巴胺耗竭，而是引起了多巴胺稳态的早期失调。一种可能的解释是，α-syn包涵体阻碍了突触小泡中多巴胺的释放或再循环，导致多巴胺“被困”在突触内，无法被正常代谢。

LIPA-α-syn包涵体在人多巴胺能神经元中诱导早期突触功能障碍

为了验证在动物模型中的发现是否在人类细胞中同样适用，研究团队在由hiPSCs分化而来的成熟人多巴胺能神经元（iDA）中重复了实验。同样地，在诱导LIPA-α-syn聚集后，他们观察到人类神经元的突触也发生了类似的病理改变：神经突触上synaptophysin阳性的膨体数量和表面积显著增加。特别值得注意的是，这种结构改变特异性地发生在那些与LIPA-α-syn包涵体共定位的突触上，而与不含有α-syn包涵体的突触或对照组突触相比，其面积没有变化。这表明α-syn包涵体本身直接导致了突触结构的异常。这一结果有力地证明，α-syn聚集诱导的早期突触病变在进化上具有保守性，也存在于人类神经元中。

综上所述，这项研究利用光遗传学LIPA系统的高时空分辨率，成功地描绘了帕金森病早期由α-突触核蛋白聚集触发的一系列关键事件的时间线。研究结果表明，α-syn在黑质多巴胺能神经元末梢（纹状体）的积累是驱动早期病理变化的始动环节。它首先引起突触前结构的异常重塑和多巴胺稳态的失调，进而破坏了下游纹状体D1-MSNs和D2-MSNs的活动平衡，最终导致神经环路的功能障碍。所有这些变化都发生在传统的多巴胺能轴突退化和明显的运动症状出现之前，精准地模拟了PD的前驱期病理。这项研究不仅为PD的“逆行性死亡”假说提供了强有力的实验证据，更重要的是，它将研究焦点引向了突触这一早期病变的靶点。这些发现提示，未来的治疗策略或许应该更早地关注如何预防或逆转α-syn在突触部位的异常聚集及其引发的功能紊乱，从而在神经退行性变不可逆转之前实现对疾病的干预。该研究为开发针对PD早期诊断和治疗的新方法提供了重要的理论依据和新的方向。