胁迫诱导的毒性基因组R环支持铜绿假单胞菌生物被膜胞外基质形成

《Nature Communications》：Stress-induced toxic genomic R-loops support biofilm extracellular matrix formation

本研究针对细菌生物被膜胞外DNA（eDNA）基质形成机制不清的问题，揭示了在氨基酸饥饿等胁迫下，铜绿假单胞菌通过激活严谨应激反应（SSR）和SOS反应，由RecA蛋白介导产生反式R环（R-loop），这些核酸结构作为关键构件赋予生物被膜粘弹性，为控制生物被膜提供了新靶点。

　　

在微生物的世界里，细菌常常不是以孤立的“浮游”状态存在，而是聚集形成被称为“生物被膜”的复杂群落。这种生活方式是细菌应对环境压力（如营养缺乏、抗生素攻击）的重要策略。生物被膜被一层粘稠的胞外基质所包裹，这层基质像保护罩一样，能有效阻碍抗菌药物的渗透，从而导致严重的抗生素耐药性问题。在构成这层基质的各种成分中，胞外DNA（eDNA）被证实是关键的粘弹性组分，但其来源和如何形成稳定网络结构一直是未解之谜。

此前的研究表明，铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）等病原体的生物被膜eDNA基质中含有RNA:DNA杂交体等特殊结构，但人们并不清楚这些核酸结构是如何被精确组装并发挥其力学功能的。特别是，一种被称为R环（R-loop）的三链核酸结构（由一条RNA:DNA杂交链和一条被置换出的单链DNA组成）通常被认为是细胞内转录等过程的副产物，若未被及时清除会导致基因组不稳定性，其是否在胞外具有生物学功能更是未知。解开这些谜团对于开发新型生物被膜控制策略至关重要。

为了回答这些问题，新加坡南洋理工大学等机构的研究人员在《Nature Communications》上发表了他们的最新研究成果。他们发现，在铜绿假单胞菌成熟的生物被膜中，存在大量的R环结构，并且这些R环是赋予eDNA基质粘弹性的关键。令人惊讶的是，这些胞外R环中的RNA并非来自其转录位点，而是由同源重组蛋白RecA在基因组其他位置插入形成的，属于“反式R环”（in trans R-loop）。这一过程由氨基酸饥饿触发的严谨应激反应（Stringent Stress Response, SSR）所启动，并通过激活SOS反应和程序性细胞死亡（Programmed Cell Death, PCD）通路，使得一部分细菌细胞“自杀”并释放出R环，作为构建群体保护性基质的“砖石”。这项研究首次揭示了胞外R环的生物学功能，将细菌的应激反应、基因组不稳定性与生物被膜的形成紧密联系起来。

为开展此项研究，作者主要运用了几项关键技术：免疫荧光显微镜技术（使用S9.6抗体特异性标记R环）用于观察生物被膜基质中R环的分布与定位；DNA-RNA免疫共沉淀测序（DRIP-seq）用于分析胞外R环中RNA的转录谱，以确定其反式特性；流变学测量用于评估生物被膜基质的粘弹性；以及针对关键基因（如recA, relA, spoT, alpA等）的转座子突变体表型分析，以验证相关通路的功能。研究中还使用了来自慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者的临床痰液样本，以验证R环在感染相关生物被膜中的存在与功能。

研究结果

细胞外R环赋予生物被膜粘弹性

研究人员通过免疫荧光显微镜观察到，在成熟的铜绿假单胞菌生物被膜基质中，R环信号与eDNA纤维高度共定位。使用能特异性降解RNA:DNA杂交链的RNase H或降解单链DNA的Nuclease P1单独处理生物被膜，只能部分减少eDNA荧光强度和粘弹性；而两者联合处理则能几乎完全降解eDNA网络并彻底消除其粘弹性。这表明R环的整体结构（包含杂交链和单链DNA）对于维持eDNA基质的力学性能至关重要。此外，缺乏R环清除酶（如拓扑异构酶I TopA和核糖核酸酶HII RnhB）的突变株形成了生物量更大、R环含量更高的生物被膜。R环同样存在于表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）生物被膜以及铜绿假单胞菌感染患者的痰液样本中，且其耗竭会消除基质的粘弹性，表明R环的作用具有普遍性。

铜绿假单胞菌生物被膜细胞外R环的含量独立于转录（即反式）

通过对胞外R环中的RNA进行测序（DRIP-seq），并与浮游细胞、生物被膜细胞内RNA和细胞外RNA的转录谱进行比较，发现R环相关的RNA表达谱更为均匀，且与高表达转录本无关。这表明胞外R环中的RNA并非简单地来自活跃的转录过程，而是以反式方式形成，即RNA分子与远离其转录位点的DNA序列杂交。这一发现排除了胞外R环是转录或转录偶联DNA修复过程副产物的可能性。

细胞外R环是铜绿假单胞菌生物被膜中SOS反应下由RecA产生的

SOS反应基因recA在生物被膜中表达上调。recA基因敲除突变株（ΔrecA）的生物被膜生物量和R环覆盖率显著降低，且其粘弹性减弱。使用甲磺酸甲酯（MMS）诱导SOS反应可增加野生型菌株的生物被膜生物量和R环含量，但对ΔrecA突变株无效。免疫荧光实验进一步在野生型生物被膜的eDNA纤维上检测到了RecA蛋白的存在。这些结果直接将RecA蛋白与胞外R环的形成和生物被膜基质的构建联系起来。

严谨应激反应和氨基酸饥饿触发细胞外R环的产生和生物被膜形成

研究发现，成熟生物被膜中严谨应激信使ppGpp的水平显著高于浮游细胞，且SSR关键基因（relA, spoT, dksA）表达上调。relA或spoT基因敲除突变株的生物被膜生物量和R环覆盖率均减少。使用丝氨酸羟肟酸盐（SHT）模拟氨基酸饥饿以激活SSR，可显著增加野生型生物被膜的生物量和R环含量，但这种效应在ΔrelA或ΔrecA突变株中消失。相反，补充甘氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸（AAmix）以缓解氨基酸饥饿，则能抑制SSR，下调recA表达，并减少生物被膜形成和R环产生。这证明了氨基酸饥饿-SSR-SOS反应轴在调控R环介导的生物被膜形成中的核心作用。

R环是受调控的死亡媒介，并使垂死细胞能够为基质组装做出贡献

添加针对R环的S9.6抗体（而非RecA抗体）能有效抑制生物被膜的形成，并破坏eDNA纤维的结构，表明R环在细胞外发挥功能。进一步研究发现，SSR激活生物被膜形成和R环产生依赖于AlpA蛋白（一个调控alpBCDE细胞裂解基因的PCD主调控因子）。ΔalpA以及细胞裂解基因（lys, hol）突变株的生物被膜形成和R环覆盖率均降低，且SHT处理无法增强其表型。这表明RecA介导的毒性反式R环插入基因组，与AlpA调控的程序性细胞裂解协同作用，共同促使R环释放到胞外基质中。

本研究结论部分指出，R环曾被认为是无计划的中间副产物，但该研究首次揭示了细胞外R环在促进生物被膜基质形成中的生物学功能。研究人员提出了一个整合模型：氨基酸饥饿激活SSR，导致ppGpp积累；ppGpp通过调控AlpA水平，在部分细胞中导向PCD而非DNA修复；在这些“自杀细胞”中，RecA蛋白介导反式R环的插入，引发基因组不稳定性；最终，细胞裂解释放的R环成为构建粘弹性生物被膜基质的关键构件。同时，在存活细胞中，RecA可能被用于DNA修复，体现了其功能的双重性。

该研究的重大意义在于，它揭示了细菌如何将应激信号转化为构建保护性群落结构的精确机制，将SSR、SOS反应、基因组不稳定性、PCD和生物被膜力学性质联系起来。由于SSR、SOS反应和R环形成机制在细菌中高度保守，这一发现可能适用于广泛的细菌物种。这为理解生物被膜相关感染（如慢性肺部感染）的顽固性提供了新视角，并提示针对R环形成通路（例如使用S9.6抗体类似物或靶向SSR/SOS信号）可能成为一种广谱的、旨在破坏生物被膜结构而非直接杀菌的抗生物被膜新策略，有望克服传统抗生素疗法所面临的挑战。