抑制截短后的Tau297–391区域中的二硫键形成，能够促进Tau蛋白自组装为具有种子结构的完整聚集体

该研究通过 truncated tau（dGAE）模型探究二硫键（DSB）在tau自组装中的作用，发现抑制DSB可加速dGAE纤维形成并缩短 lag phase，且DSB抑制体（dGAE+DTT和dGAE-C322A）在体外和细胞模型中表现出更强的种子能力，其纤维结构具有更高的β-折叠有序性和蛋白酶抗性，提示DSB抑制是tau病理聚集的关键步骤。

　　
tau蛋白自组装机制与二硫键作用的研究进展

tau蛋白自组装过程在神经退行性疾病中具有关键作用，但相关机制仍存在争议。本研究通过 truncated tau变体dGAE的系统性研究，揭示了二硫键（disulfide bonding, DSB）对tau纤维形貌、聚合动力学及细胞内seeding能力的多维度影响。

一、研究背景与模型构建
tau蛋白在正常生理状态下负责维持微管网络稳定性，但当其发生异常自组装时，会形成具有病理特征的纤维态聚集体。不同tau病理类型（如阿尔茨海默病PHF、CTE型II纤维）对应着独特的纤维构象，这种构象多样性源于tau蛋白重复序列的构象柔性。本研究选用297-391位氨基酸的dGAE片段，该片段已证实能够自组装形成与临床病理标本高度相似的纤维结构。

二、聚合动力学机制解析
通过硫黄素T（ThS）荧光动力学检测发现，dGAE的聚合过程呈现典型三级动力学特征：初始的lag期（潜伏期）、指数增长期和平台期。重要发现包括：
1. 聚合速率常数显示，抑制DSB（使用DTT或C322A突变体）可使聚合速率提升2-3倍，同时显著缩短lag期（从34小时降至12小时）
2. 汇总动力学模型显示，次级成核（表面介导型）和断裂-延伸循环共同主导聚合过程，这与β-淀粉样蛋白等其他蛋白质的聚合特征一致
3. 体外预成核实验表明，dGAE-C322A（抑制DSB）形成的纤维具有更强的成核能力，其诱导效率较未抑制DSB条件提升5-8倍

三、纤维构象与分子特性差异
透射电镜（TEM）和圆二色谱（CD）分析揭示了DSB状态对纤维结构的影响：
1. 非还原条件下（+DSB），形成 twisted纤维束（PHF型），且存在明显的分子重排
2. 还原条件（-DSB）或突变体条件下，纤维呈现更规整的线性结构，且具有更高的表面疏水性
3. CD谱显示，抑制DSB的纤维在225nm处存在特征吸收峰，表明存在tyrosine残基的有序堆积

四、蛋白ase K敏感性分析
SDS-PAGE结合蛋白酶K（PK）消化实验发现：
1. 非还原态dGAE纤维在PK处理下产生12kDa和8kDa特征条带，表明存在两种不同的纤维构象
2. 还原态（dGAE+DTT）和突变体（dGAE-C322A）纤维在PK处理后仅显示8kDa条带，说明其核心区域更稳定
3. 聚合体系中非还原态dGAE存在明显的二聚体（24kDa）积累，这种二聚体可能阻碍次级成核过程

五、细胞内成核能力验证
利用tau生物传感器细胞（携带CFP/YFP双荧光标记的P301S突变体tau）进行实验：
1. 未抑制DSB的dGAE纤维无法有效诱导细胞内tau聚合
2. 抑制DSB的dGAE+DTT和dGAE-C322A纤维可显著增强荧光 puncta形成（强度提升10-50倍）
3. 预处理后的短纤维（经超声破碎）具有更强的细胞摄取能力，成核效率较完整纤维提高3倍

六、分子机制假说
研究提出双相成核模型解释DSB的影响：
1. 正常聚合过程包含两个阶段：
- 初级成核：形成具有DSB的中间体（12kDa单体/24kDa二聚体）
- 次级成核：纤维表面介导的链延伸与断裂-延伸循环
2. DSB抑制后，初级成核受阻（二聚体减少90%），次级成核主导（平台期缩短40%）
3. 超分子结构差异导致纤维表面暴露的成核位点数量变化（抑制DSB后表面暴露位点增加2.3倍）

七、病理相关性分析
1. 模拟AD病理环境（非还原态）的纤维更易形成寡聚体复合物（直径50-200nm）
2. 抑制DSB形成的纤维（dGAE+DTT）具有更高的热稳定性（Tm值提高15℃）
3. 纤维长度与成核效率呈正相关（400μM条件下纤维长度达15μm时成核效率最高）

八、研究意义与展望
1. 理论价值：首次系统阐明DSB对tau纤维成核能力的双重作用（促进纤维形成但抑制成核效率）
2. 模型创新：dGAE-C322A/DTT体系可精准控制纤维构象，为开发靶向药物提供平台
3. 临床启示：还原性环境（如细胞质）更有利于病理纤维的形成，提示抗氧化治疗可能具有潜在应用价值
4. 研究局限：未完全排除其他二硫键的影响，且体外模型与体内环境的差异仍需验证

本研究通过建立严格的体外成核模型，结合多维度结构表征手段，系统解析了DSB在tau纤维形成中的调控机制。特别发现突变体dGAE-C322A在聚合动力学和成核效率上较DTT处理条件更具优势，这可能与突变体完全消除DSB形成能力有关。后续研究可结合冷冻电镜原位成像，实时观测纤维成核过程中的构象演化，为开发靶向纤维形成过程的抗tau药物提供新思路。