《Archives of Biochemistry and Biophysics》：N-terminal KTKEGV motif lysine residues of α-Synuclein are critical for TLR2 interaction and activation
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αSyn N末端通过KTKEGV基序的赖氨酸与TLR2结合并激活NF-κB通路，加剧神经炎症，帕金森病机制研究。
Krishna Singh Bisht | Manisha Kumari | Tushar Kanti Maiti
功能蛋白质组学实验室，区域生物技术中心，NCR生物技术科学集群，法里达巴德，121001，印度
摘要
突触核蛋白病（如帕金森病）涉及广泛的细胞内蛋白质聚集。α-突触核蛋白（αSyn）是这些被称为路易小体的聚集物的主要成分，而这些聚集物与神经退行性变有关。研究表明，αSyn可以从受感染的神经元传播到健康的神经元，从而扩散病理。在传播过程中，αSyn还通过与胶质表面受体（如Toll样受体（TLRs）相互作用来激活小胶质细胞。这种激活会促进白细胞介素和促炎细胞因子的产生，通过慢性神经炎症加剧神经元死亡。然而，αSyn与TLR相互作用的机制尚未完全阐明。在这项研究中，我们使用生物物理方法在HEK-TLR2细胞中证明了αSyn的N端具有更高的与TLR2的结合亲和力。这种相互作用是通过αSyn第二和第三个KTKEGV基序中的赖氨酸残基介导的。N端KTKGEV基序中的赖氨酸到丙氨酸突变会干扰αSyn/TLR2的相互作用。我们还证明了第二和第三个KTKEGV基序中的赖氨酸残基对于αSyn介导的TLR2激活至关重要。我们的研究表明，N端KTKEGV赖氨酸残基有助于αSyn与TLR2的相互作用，从而调节αSyn介导的神经炎症。
引言
突触核蛋白病是一组神经退行性疾病，包括帕金森病（PD）和路易小体痴呆（DLB）等。这些疾病的特点是神经元和胶质细胞中错误折叠的αSyn蛋白发生病理性的聚集[1]。这些聚集的αSyn是称为路易小体（LB）的蛋白质胞质包含物的主要成分[2]。αSyn具有类似朊病毒的特性，并被认为可以从肠神经系统和外周神经系统传播到中枢神经系统[3]。αSyn是一种丰富的神经元蛋白，在突触小泡回收和神经元稳态中起作用[4][5]。αSyn由三个不同的区域组成：一个两亲性螺旋结构的N端区域（aa 1–60），一个疏水性的中心区域（称为阿尔茨海默病的非Aβ成分（NAC）（aa 61–95），以及一个酸性的C端区域（aa 96–140）[6]。αSyn的N端区域负责单体和寡聚体与脂质膜的相互作用[7]。NAC区域被认为有助于β-折叠片段的形成和聚集[8][9]。C端区域主要无序，并与金属离子相互作用[10]。αSyn具有独特的、保守的七个KTKEGV基序，这些基序贯穿N端和NAC区域[11][12]。这些KTKEGV基序是αSyn四聚化以及维持单体与四聚体比例的介质[13]。
由于其结构灵活性，αSyn会根据环境和结合伴侣的不同采取多种构象[14]。αSyn通过多种遗传突变、拷贝数变化或表达上调而获得神经毒性[1][16][17]。通过一系列事件，可溶性的αSyn单体最初形成寡聚体，然后逐渐结合形成小的原纤维，最终形成大的不溶性淀粉样纤维[17][18]。这些聚集的寡聚体和纤维状物质会导致膜损伤、突触功能障碍、细胞器毒性，最终导致细胞死亡[19][20][21]，但神经毒性的上游机制仍不清楚。
研究表明，有毒的αSyn寡聚体可以在细胞间传播并引发内源性αSyn的病理[22]。通过表面受体识别和摄取细胞外的αSyn是细胞间传播病理αSyn的关键机制[23][24][25]。细胞外的病理αSyn通过激活胶质细胞引发炎症反应，胶质细胞会吞噬并清除这些致病物质[27]。
TLR2是一种存在于小胶质细胞和神经元细胞表面的细胞表面受体，可介导对损伤相关分子模式（DAMPs）的先天免疫反应[28]。在人类PD和DLB患者的脑中，TLR2的表达增加[29][30]。在αSyn小鼠模型中，敲低TLR2可以减少神经元丢失和胶质细胞激活，通过诱导自噬来预防突触核蛋白病[31]。细胞外释放的αSyn寡聚体被小胶质细胞的TLR2识别，激活受体复合物并产生促炎细胞因子反应，进一步导致慢性神经炎症[32][33]。抑制这种相互作用可以减少激活的小胶质细胞表型和促炎细胞因子的释放[31]。αSyn与TLR2的相互作用对构象敏感，αSyn寡聚体比单体和纤维更易被TLR2识别[32]。然而，参与这种相互作用的αSyn区域尚不清楚。先前的研究表明，富含β片的αSyn中间体比富含螺旋的中间体与TLR2的相互作用更有效[34]。因此，理解αSyn与TLR2的相互作用对于研究突触核蛋白病至关重要。然而，αSyn与TLR2相互作用的具体机制仍不清楚。
在这项研究中，我们探讨了αSyn的结构特性在介导其与TLR2相互作用中的作用。我们提供了证据，证明αSyn通过其N端的赖氨酸残基与TLR2相互作用。αSyn与TLR2的相互作用是通过αSyn单体和寡聚体N端部分的KTKEGV基序介导的。此外，第二和第三个KTKEGV基序中的赖氨酸残基有助于这种相互作用以及TLR2介导的途径的激活。
部分摘要
α-突触核蛋白、截短的α-突触核蛋白结构域及赖氨酸突变体的表达与纯化
这些蛋白质使用pT7-7质粒（Addgene，36046）在BL21（DE3）大肠杆菌细胞中表达。通过定点突变和分子克隆引入截短和突变（引物列表见补充表1）。蛋白质的纯化方法如先前报道[35]，此处简要描述。BL21（DE3）大肠杆菌细胞在37°C、180 rpm的LB培养基中生长。当OD600达到0.6时，加入1 mM IPTG进行诱导
α-突触核蛋白N端区域与TLR2相互作用并激活NF-κB表达
αSyn在与小胶质细胞表面的TLR2受体结合后激活小胶质细胞[33]。然而，αSyn与TLR2的物理相互作用尚未得到充分研究。在我们之前的研究中，我们已经证明αSyn与hTLR2相互作用并激活BV2小胶质细胞，分泌促炎细胞因子[34]。然而，这种相互作用是如何开始的以及αSyn的哪些区域和残基参与其中仍不清楚。因此，我们的目标是
讨论
αSyn诱导的小胶质细胞激活和神经炎症在突触核蛋白病（包括PD和DLB）中的作用已被充分描述。小胶质细胞摄取细胞外的αSyn并帮助其通过自噬清除和细胞间传播[47]。细胞表面受体如TLR2、TLR4、RAGE、FCRγRIIB、LAG3和CD11b可能介导这些细胞外致病αSyn的作用[23][48][49][50][51][52][53]。已知TLR2受体可诱导小胶质细胞的炎症反应
资助和附加信息
KSB和MK感谢科学技术部（DST）提供的INSPIRE奖学金。TKM感谢区域生物技术中心（RCB）的资助。
CRediT作者贡献声明
Manisha Kumari：写作 – 审稿与编辑、方法学。Krishna Singh Bisht：写作 – 审稿与编辑、初稿撰写、可视化、验证、资源获取、方法学、实验设计、概念化。Tushar Maiti：写作 – 审稿与编辑、监督、资源管理、项目协调、方法学、资金申请、概念化
数据可用性声明
所有实验数据均包含在手稿和支持信息中。
致谢
我们感谢Hilal Lashuel教授提供的α-突触核蛋白质粒Addgene 36046（pT7-7）。我们感谢RCB和ATPC在生物物理和显微镜设施方面提供的技术支持。同时感谢ATPC的RCB中央仪器设施和BLI设施。
