m6A RNA甲基化在早期胚胎谱系中维持X染色体失活和X-常染色体剂量补偿的作用

《Stem Cell Reports》：The role of m6A RNA methylation in the maintenance of X chromosome inactivation and X-to-autosome dosage compensation in early embryonic lineages

本研究针对m6A RNA甲基化在剂量补偿中的作用尚不明确的问题，通过研究早期胚胎干细胞（XENs、TSCs、EpiSCs），发现m6A缺失不影响X染色体失活（XCI）维持，但部分破坏了X-常染色体（X-to-A）剂量补偿，且这种作用具有细胞类型特异性，为理解表观转录组调控在发育中的作用提供了新视角。

　　

在哺乳动物中，雌性个体通过一条X染色体的失活来平衡两性间X连锁基因的剂量，这被称为X染色体失活。然而，这又带来了新的问题：仅剩一条有活性的X染色体，其上的基因表达量如何与拥有两个拷贝的常染色体基因相匹配？这就是著名的X-常染色体剂量补偿问题。数十年来，关于哺乳动物是否通过上调活性X染色体的表达来实现剂量补偿的争论一直存在。近年来，随着单细胞等位基因分辨转录组分析技术的发展，证据表明在早期胚胎发生过程中，伴随着失活X染色体上基因的沉默，活性X染色体确实发生了协调性的上调。但维持这种精妙平衡的分子机制，尤其是新兴的表观转录组调控因子——N⁶-甲基腺嘌呤（m⁶A）RNA甲基化在其中扮演的角色，仍是一个有待深入探索的领域。

为了回答m⁶A RNA甲基化是否参与以及如何参与维持X染色体失活和X-常染色体剂量补偿，研究人员将目光投向了早期胚胎发育过程中的关键干细胞谱系。这些谱系包括代表胚外内胚层的XEN细胞、代表滋养外胚层的TSC细胞以及代表着床后外胚层的EpiSC细胞。这些细胞不仅处于发育的关键窗口期，而且其X染色体失活状态（印记失活或随机失活）各不相同，为研究提供了独特的模型。

本研究主要运用了等位基因特异性RNA测序（RNA-seq）分析、m⁶A RNA甲基化免疫共沉淀测序（MeRIP-seq）、以及基于GLORI（glyoxal and nitrite-mediated deamination）技术的m⁶A单碱基分辨率定量分析。研究人员利用METTL3甲基转移酶抑制剂STM2457在干细胞中特异性降低m⁶A水平，并通过液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）验证了抑制效率。

RESULTS

Depletion of m⁶A RNA methylation does not perturb the maintenance of X-linked gene silencing in XENs, TSCs, and EpiSCs

为了探究m⁶A在维持X染色体失活中的作用，研究团队首先在XEN、TSC和EpiSC细胞中检测了Xist RNA（X失活特异性转录本，X-inactive specific transcript）上的m⁶A修饰，发现其在外显子1和7存在甲基化。随后，他们使用STM2457抑制METTL3活性，成功将细胞内的m⁶A水平降低了70%以上。通过等位基因特异性RNA-seq分析发现，尽管m⁶A被有效去除，但在这些干细胞中，原本失活的X染色体（XMus）上的基因沉默状态并未被大规模破坏。Xist RNA的表达在TSC和EpiSC中保持稳定，仅在XEN中有轻微下降。染色体水平的表达分析显示，绝大多数X连锁基因仍保持单等位基因表达（来自活性X染色体XMol），只有极少数基因在m⁶A缺失后出现了重新激活的迹象。这表明，在研究的这些早期胚胎谱系中，m⁶A RNA甲基化对于维持已经建立的X染色体失活状态并非必需。

m⁶A is less enriched in X-linked transcripts compared to the autosomal transcripts in early embryonic lineages

接下来，研究人员比较了X连锁转录本和常染色体转录本上m⁶A的富集程度。通过对早期胚胎发育各个阶段（从生发泡期卵母细胞到囊胚）以及多种胚胎和体细胞系（包括XEN、TSC、EpiSC、ESC、MEF等）的MeRIP-seq数据进行分析，他们发现了一个普遍趋势：从2-细胞期开始，X连锁转录本上的m⁶A修饰水平显著低于常染色体转录本。这一模式在大多数分析的细胞类型和组织中保持一致，尽管在少数组织（如中脑和6周海马）中未观察到显著差异。利用更精确的GLORI技术进行的定量分析进一步证实了这一发现。这表明，X连锁转录本相较于常染色体转录本具有较低的m⁶A甲基化水平，这一特征在进化上可能具有保守性。

The extent of X-to-autosome dosage compensation varies with the m⁶A methylation level of X-linked transcripts

既然X和常染色体转录本的m⁶A修饰水平存在差异，而这种修饰已知会影响RNA的稳定性，那么它是否与剂量补偿的程度相关呢？研究人员通过计算活性X染色体与常染色体的等位基因表达比率（XMol:AMol）来评估剂量补偿的程度。结果证实，在XEN、TSC和EpiSC中确实存在有效的剂量补偿（X:A比率接近2）。进一步分析显示，当将X连锁基因根据其转录本是否被m⁶A修饰进行分组后，未被m⁶A修饰的X连锁基因的X:A比率显著高于被修饰的基因。这意味着，m⁶A甲基化水平较低的X连锁基因获得了更高程度的上调，从而实现了更充分的剂量补偿。GLORI数据的分析也支持这一结论：m⁶A甲基化水平越低的X连锁转录本，其X:A比率越高。

Depletion of m⁶A RNA methylation has minor effects on maintaining X-to-autosome dosage compensation

最后，研究直接测试了m⁶A缺失对剂量补偿维持的影响。在STM2457处理（m⁶A缺失）的XEN、TSC和EpiSC细胞中，整体的X:A比率出现了轻微下降，但在TSC和XEN中未达到统计学显著性，仅在EpiSC中下降显著。深入分析发现，m⁶A缺失并未显著改变活性X染色体上基因的表达水平，但影响了常染色体基因的表达，特别是在XEN和TSC中。此外，对于未被m⁶A修饰的X连锁基因，其X:A比率在m⁶A缺失后表现出下调的趋势。研究人员还将分析扩展到其他已发表的数据库，发现在某些细胞系（如ESC、HEK293T）中m⁶A抑制会导致X:A比率显著降低，但在许多通过基因敲除（KO）或敲低（KD）METTL3或METTL14来去除m⁶A的模型中，X:A比率的变化并不显著或非常微小。同样，敲除m⁶A去甲基化酶FTO也未显著改变X:A比率。这些结果表明，m⁶A RNA甲基化对X-常染色体剂量补偿的维持具有一定贡献，但这种作用是部分的，并且在很大程度上依赖于细胞类型的具体背景。

DISCUSSION

本研究系统地探讨了m⁶A RNA甲基化在剂量补偿中的双重角色。主要结论是：在早期胚胎干细胞（XEN、TSC、EpiSC）中，m⁶A对于维持已经建立的X染色体失活状态是非必需的；然而，它在微调X-常染色体剂量补偿方面扮演了角色，尽管这种作用是部分的且具有细胞类型特异性。研究揭示了X连锁转录本普遍具有较低m⁶A修饰水平的现象，并首次在多种早期胚胎谱系中证实了m⁶A甲基化水平与剂量补偿程度之间的负相关关系。这意味着，较低的m⁶A水平可能有助于X连锁转录本获得更高的稳定性，从而部分抵消因其单拷贝状态导致的表达量劣势。然而，m⁶A缺失仅引起剂量补偿的轻微失调，提示体内可能存在其他冗余或更主要的机制（如转录水平调控）共同确保剂量平衡的鲁棒性。这项发表在《Stem Cell Reports》上的工作，为理解表观转录组调控在哺乳动物早期发育和细胞命运决定中的复杂功能提供了重要的新见解，强调了在特定发育背景和细胞类型中研究基因调控机制的重要性。未来的研究需要更长时间的m⁶A干预以及探索m⁶A与其他表观遗传途径的相互作用，以更全面地揭示剂量补偿的维持网络。