SUMO特异性蛋白酶SPF1与SPF2通过介导WRI1去SUMO化负调控种子油脂合成

《Plant Communications》：SUMO-specific proteases SPF1 and SPF2 negatively regulate seed oil synthesis by mediating WRI1 deSUMOylation

本研究揭示了拟南芥中SUMO特异性蛋白酶SPF1和SPF2通过介导关键转录因子WRI1的去SUMO化修饰，负调控种子油脂合成的分子机制。研究人员发现spf1/spf2双突变体种子更大、含油量显著提高，证明WRI1是SPF1/SPF2的直接作用底物，其SUMO化修饰（主要位点K257）能增强蛋白稳定性。该研究首次建立了SUMO化-去SUMO化动态开关调控油脂合成的完整通路，为油料作物遗传改良提供了新靶点。

　　

种子是植物繁衍后代的重要器官，也是人类获取食用油和工业用油的主要来源。提高种子含油量一直是作物遗传改良的重要目标。在模式植物拟南芥中，WRINKLED1（WRI1）作为APETALA2/EREBP转录因子家族的成员，是调控种子油脂合成的关键主效因子，直接控制脂肪酸合成途径多个关键基因的表达。然而，科学家们对WRI1蛋白自身的转录后调控机制，特别是蛋白质翻译后修饰如何影响其稳定性和活性的认识仍不完善。

SUMO化是一种重要的蛋白质翻译后修饰过程，类似于泛素化，但功能迥异。它通过E1（激活酶）、E2（结合酶）、E3（连接酶）级联反应将SUMO（小泛素样修饰物）共价连接到靶蛋白的特定赖氨酸残基上，从而调控蛋白的稳定性、亚细胞定位和相互作用。这一过程可被SUMO特异性蛋白酶逆转，即去SUMO化。在拟南芥中，SUMO蛋白酶SPF1和SPF2已被报道参与开花时间、光信号传导等过程，但它们在种子发育特别是油脂合成中的作用仍是未知领域。

为了解决这一科学问题，中国科学院遗传与发育生物学研究所胡赞民研究员团队在《Plant Communications》上发表了最新研究成果。研究人员综合运用遗传学、生物化学和分子生物学等多种技术手段，包括基因表达分析（RNA-seq）、酵母双杂交（Y2H）、双分子荧光互补（BiFC）、分裂荧光素酶互补（SFLC）、体外SUMO化/去SUMO化 assays、细胞游离降解实验以及气相色谱-火焰离子化检测器（GC-FID）分析种子油脂含量等，系统阐明了SPF1/SPF2-WRI1模块在调控种子油脂合成中的核心作用。

SPF1和SPF2负调控种子大小和含油量

研究人员首先观察到，与野生型（WT）相比，spf1-1、spf2-1单突变体以及spf1-1 spf2-1双突变体的成熟种子面积显著增大。更重要的是，通过GC-FID分析发现，这些突变体的种子含油量（SOC）也显著提高，其中双突变体的效果最为明显，增加了6.46个百分点。相反，SPF1或SPF2的过表达则导致种子变小、含油量降低。这些结果明确表明SPF1和SPF2是种子大小和油脂合成的负调控因子。

SPF1、SPF2和SUMO1与WRI1相互作用

为了探究分子机制，研究人员对10天和14天龄的种子进行了转录组测序（RNA-seq）。分析发现，在突变体中，与脂肪酸合成、糖酵解和油脂代谢相关的基因显著上调，其中许多是WRI1的已知直接靶基因。这提示WRI1可能参与了SPF1/SPF2的调控通路。通过酵母双杂交、分裂荧光素酶互补和双分子荧光互补实验，研究人员证实了WRI1与SPF1、SPF2以及SUMO1之间存在直接的物理相互作用，且相互作用发生在细胞核内。值得注意的是，WRI1不与其他的SUMO蛋白酶（如OTS1, OTS2, ESD4, ELS1）或其他SUMO旁系同源物（SUMO2, SUMO3, SUMO5）相互作用，显示了相互作用的特异性。

WRI1位于SPF1和SPF2的下游

为了确定SPF1、SPF2和WRI1之间的遗传关系，研究人员构建了双突变体和三突变体。遗传分析表明，spf2-1 wri1-3和spf1-1 spf2-1 wri1-3突变体的种子表现出与wri1-3单突变体相似的皱缩表型，并且其含油量也降至wri1-3的水平。虽然由于胚胎致死性未能获得纯合的spf1-1 wri1-3双突变体，但获得的杂合子表型部分恢复。这些结果证明WRI1在遗传上位于SPF1和SPF2的下游，共同调控种子油脂合成。

WRI1是SUMO1的底物蛋白

通过生物信息学预测和序列比对，研究人员发现WRI1蛋白中存在两个保守的SUMO化修饰位点，即K257和K266，这两个位点在十字花科植物中尤其保守。利用体内SUMO化实验，他们在转基因拟南芥植株中成功检测到SUMO化的WRI1蛋白条带。体外重构SUMO化系统实验进一步证实WRI1可以被SUMO化，并且K257是主要的SUMO化位点，K266次之。

Lys257是WRI1关键的SUMO化位点

为了探究SUMO化修饰的功能意义，研究人员构建了WRI1及其SUMO化位点突变体（K257R, K266R）的过表达和回补株系。研究发现，突变K257位点会显著降低WRI1的SUMO化水平，并加速其蛋白降解，导致其回补wri1-3突变体皱缩表型的能力大大减弱，种子含油量也显著降低。而K266R突变的影响则较小。这些结果确立了K257作为WRI1关键SUMO化位点的重要性，该位点的修饰对于维持WRI1蛋白稳定性和促进油脂合成至关重要。

SPF1介导WRI1的去SUMO化

体外去SUMO化实验表明，SPF1能够以时间依赖性和其蛋白酶活性依赖的方式，有效地去除WRI1上的SUMO修饰。当加入SUMO蛋白酶抑制剂N-乙基马来酰亚胺（NEM）时，SPF1的去SUMO化活性被抑制。

SPF1和SPF2负调控WRI1稳定性

通过瞬时表达和蛋白稳定性分析，研究人员发现SPF1和SPF2的过表达会降低WRI1的蛋白水平，而在spf1 spf2双突变体中，WRI1蛋白，特别是其SUMO化形式，显著积累。细胞游离降解实验也证实，在spf1和spf2突变体中，WRI1的降解速度明显慢于野生型。这些证据充分表明，SPF1和SPF2通过介导WRI1的去SUMO化，促进了WRI1的降解，从而负调控其蛋白稳定性。

综上所述，本研究揭示了SUMO蛋白酶SPF1和SPF2通过精确调控核心转录因子WRI1的SUMO化修饰水平，从而动态控制种子油脂合成的分子开关。在野生型植物中，SPF1/SPF2介导的去SUMO化作用使WRI1保持在一个适度的周转水平，限制油脂的过度合成。而在spf1/spf2突变体中，去SUMO化作用缺失导致SUMO化的WRI1大量积累，其稳定性增强，进而强力激活下游脂肪酸合成基因的表达，最终导致种子含油量显著提高。这项工作不仅首次将SUMO化修饰与植物油脂合成调控直接联系起来，发现了关键的SUMO化位点和负责去SUMO化的酶，而且阐明了SPF1/SPF2-WRI1模块作为一个精细调控节点的核心作用。该研究为理解种子发育过程中油脂积累的精确调控提供了新视角，也为通过基因编辑等技术精准调控SUMO化修饰来改良油料作物的含油量奠定了重要的理论基础，具有重要的科学意义和应用潜力。