基于转录本信息的靶向细胞富集技术，用于大规模单核RNA测序

《Cell Genomics》：Transcript-guided targeted cell enrichment for scalable single-nucleus RNA sequencing

靶向snRNA-seq方法EnrichSci及其在老年 oligodendrocytes中的应用（

　　
### 研究解读：靶向稀有细胞类型的单细胞转录组测序技术EnrichSci及其在老年小鼠脑 oligodendrocytes中的应用

#### 1. 研究背景与挑战
哺乳动物器官中存在大量稀有细胞类型（如<0.01%的脑 pinealocytes），传统单细胞测序技术因通量低、成本高，难以系统解析其分子异质性。现有靶向方法（如PERFF-seq）存在微流控设备依赖性强、样本规模受限等问题。本研究开发了一种新型高通量技术EnrichSci，通过结合杂交链式反应（HCR）和易科单细胞测序平台（EasySci），实现了抗体免费、高分辨率的稀有细胞类型分析。

#### 2. EnrichSci技术核心
- **双轨富集策略**：通过设计5-10个靶向基因的探针组（如oligodendrocytes特异性基因Mag、Galnt6等），结合HCR RNA荧光原位杂交技术，在核提取阶段实现目标细胞富集。实验表明，该技术可将oligodendrocytes丰度从传统单细胞测序的5.7%提升至93%，纯度提高16倍。
- **全长转录组覆盖**：采用双引物法（oligo-dT和随机六聚体），确保从转录起始位点至poly-A尾的全长基因捕获，特别适用于研究剪接异构体（如Zbtb16基因在老年小鼠中exon7使用率增加23%的发现）。
- **高通量设计**：通过组合索引（combinatorial indexing）实现单次实验处理百万级细胞，成本降至$0.001/cell，较传统 sci-RNA-seq技术降低2个数量级。

#### 3. 技术验证与优化
- **体外混合细胞验证**：通过 NIH/3T3（鼠源）、HeLa（人源）等四类细胞线混合样本，成功实现亚细胞类型分离（如MOL2亚型中Klk6高表达群体占比达87%），验证了探针组设计的特异性。
- **关键步骤优化**：
- **核固定条件**：优化甲醛浓度（0.4% vs常规4%）和固定时间（15min vs1h），在保证HCR信号强度的同时（OD值>1.2），使核回收率提升至30%。
- **探针浓度梯度**：通过调整探针浓度（4-16nM），发现当浓度超过16nM时，背景信号干扰（非靶向结合率升高至12%），最终确定10nM为最佳工作浓度。
- **样本存储**：验证了核样本在4℃保存6天后仍能获得完整数据（UMI回收率波动<5%）。

#### 4. 老年小鼠脑 oligodendrocytes的分子特征
- **细胞亚型分异**：基于BICCN分类体系，发现脑 oligodendrocytes包含5类成熟亚型（MOL2/MOL5/6等），其中MFOL向MOL5/6转化比例在老年组（25月龄）较青年组（2月龄）增加40%。
- **基因表达层变化**：
- **共享调控网络**：在MOL2和MOL5/6中共发现119个差异基因（FDR<0.05），其中23%为氧化应激相关基因（如Map3k5表达下降37%），18%涉及细胞凋亡（如Pik3r3上调2.1倍）。
- **剪接因子异常**：Drosha/NRPA1等剪接因子在MOL2亚型中表达量增加（logFC=1.8, FDR=0.03），其靶向基因（如Plp1）的剪接异构体使用率发生显著偏移（exon3使用率从12%增至19%）。
- **外显子动态图谱**：通过短读测序发现：
- **Zbtb16基因外显子7**：老年组中该外显子使用率提升15%，与长读测序（PacBio）确认的isoform 201（exon7+/-）丰度增加一致。
- **功能域富集**：DE exons（差异外显子）中，"heat shock protein"（Hsp90aa1等）和"DNA binding domain"（Zhx3等）构成主要功能模块，占比达68%。

#### 5. 年龄相关分子机制
- **能量代谢重塑**：MOL5/6亚型中与糖脂代谢相关基因（Sorl1、Ubb）表达量下降（FC=0.62, p=0.003），提示线粒体功能衰退。
- **炎症反应激活**：MOL2亚型中C4b（补体成分）和Serpina3n（急性期反应蛋白）外显子剪接异常，其共表达网络（WGCNA）显示与血脑屏障破坏相关通路（p=0.008）。
- **氧化损伤累积**：Hsp90ab1（热休克蛋白）外显子水平下调（FC=0.71, p=0.001），其靶向基因（如Gpx4）的剪接异构体多样性增加2.3倍。

#### 6. 技术创新与局限
- **创新点**：
1. 首次实现单细胞水平外显子动态分析（平均检测23个差异外显子/细胞）
2. 开发探针设计算法（基于UCSC基因组浏览器定位内含子边界）
3. 建立跨物种标准化流程（鼠源样本外显子捕获率98.7%）
- **局限性**：
- 样本规模限制：目前最大单次实验规模为2×10^7细胞，难以满足器官级分析
- 剪接机制解析不足：仅确认8% DE exons存在明确剪接因子调控（如Nova1靶向基因转录本占比>5%）
- 时空分辨率待提升：现有方法无法区分单细胞在脑区（如皮质vs小脑）中的年龄相关差异

#### 7. 应用前景与延伸方向
- **疾病关联研究**：MOL5/6亚型中Nfkb1外显子剪接异常与阿尔茨海默病病理标志（Aβ42沉积）显著正相关（r=0.71, p=1.2e-5）
- **药物靶点发现**：Zbtb16基因在老年MOLs中剪接多样性增加（3种 isoform vs青年组的1种），提示其作为抗衰老治疗靶点的潜力
- **技术扩展**：与空间转录组结合可建立"细胞-空间-时间"三维图谱（如海马区MOL5/6在老年期向皮质扩散的轨迹）

#### 8. 方法论突破
- **双阶段富集机制**：HCR探针（靶向细胞特异性基因）与EasySci的UMI标记（全局转录活性）形成互补，实现稀有细胞（<1%总核）的定量分析（检测灵敏度达0.3%丰度）
- **成本效益优化**：通过探针复用技术（单探针可检测>200种细胞类型），将探针成本从$500/种降至$25/种
- **质量控制体系**：建立三级过滤机制（UMI计数>500，基因数>100，UMI多样性>0.8），使有效细胞率提升至92%

#### 9. 理论贡献
- **表观遗传调控假说**：外显子水平变化与DNA甲基化（5hmC水平下降31%）呈负相关，提示组蛋白修饰可能参与调控
- **细胞命运时钟理论**：建立oligodendrocyte成熟度评分系统（基于5个时间点基因表达轨迹），老年组细胞提前3个月进入终末分化阶段

#### 10. 行业影响
- **技术转化**：与Illumina合作开发定制化测序芯片（2000 wells/plate），检测通量提升40倍
- **标准化进程**：建立单细胞转录组分析QC标准（UMI计数CV<15%，基因覆盖度>99%）
- **成本革命**：将靶向稀有细胞分析成本从$50/cell降至$0.008/cell，推动大规模人群队列研究

#### 结论
EnrichSci技术为解析稀有细胞类型提供了标准化解决方案，在oligodendrocytes研究中发现年龄相关剪接异构体动态（如Zbtb16 isoform switching），为神经退行性疾病治疗提供了新靶点。未来需结合多组学数据（如空间转录组、ATAC-seq）建立完整的"分子-结构-功能"三维分析框架。