miR-219a-Robo1轴：调控Slit介导的连合轴突导向的保守开关机制

《iScience》：miR-219a-Robo1 axis acts as a conserved switch for slit-mediated commissural axon guidance

本研究揭示了在脊髓连合轴突导向过程中，miR-219a通过靶向Robo1 mRNA的3'非翻译区(3'UTR)调控其蛋白翻译，从而精确控制轴突对Slit排斥信号的敏感性。研究人员利用鸡和小鼠模型，结合体内外实验证实，该轴在防止连合轴突过早排斥、确保其正确跨越中线中发挥关键作用，为理解神经环路发育的精细调控提供了新机制。

　　

在神经系统发育的宏伟蓝图中，无数神经元的轴突需要穿越漫长的路径，与正确的目标建立连接，从而形成复杂的神经网络，确保大脑和脊髓的正常功能。在这一过程中，一个尤为关键的步骤是轴突跨越身体中线，形成连接左右两侧的“连合”通路。脊髓连合轴突(Commissural Axon, CA)的导向是一个经典模型，其投射路径受到多种导向因子及其受体的精密调控。其中，排斥性导向因子Slit及其受体Robo(Roundabout)构成的信号通路在防止轴突错误投射中扮演着核心角色。有趣的是，连合轴突在跨越中线前后对Slit信号的敏感性截然不同：跨越中线前，轴突对来自腹侧中线底板(Floor Plate, FP)的Slit信号不敏感，从而能够顺利向中线生长；而一旦跨越中线，轴突则迅速获得对Slit的排斥性，从而避免折返，并转向头侧投射。这种敏感性的“开关”转换，其核心在于Robo1受体在轴突表面的时空表达调控——前跨段轴突Robo1蛋白水平低，后跨段则显著升高。然而，长期以来，这种Robo1蛋白表达的精细时空调控机制，尤其是翻译水平的调控，仍不甚清晰。

为了回答这一关键科学问题，发表在《iScience》上的这项研究深入探索了microRNA(miRNA)在其中的潜在作用。研究人员推测，可能存在某种或某些miRNA，在连合轴突中差异表达，并通过与Robo1 mRNA的3'UTR结合，在翻译水平抑制其蛋白合成，从而实现对Slit敏感性的精准控制。

为验证这一假说，研究团队首先通过数学1(Math1/Atoh1)增强子驱动的Venus YFP特异性标记鸡胚脊髓中的dI1连合神经元(Commissural Neurons, CNs)，并利用荧光激活细胞分选术(Fluorescence-Activated Cell Sorting, FACS)分离这群神经元，进行小RNA测序。通过对测序数据的生物信息学分析，并结合TargetScan和miRDB等预测工具，他们筛选出7个可能靶向鸡Robo1(cRobo1)的miRNA候选者。其中，高度保守的miR-219a因其在预测中与cRobo1 3'UTR有强结合位点，且在前期跨段CNs中高表达，引起了研究人员的特别关注。

研究人员随后详细描绘了miR-219a、cRobo1 mRNA和cRobo1蛋白在鸡脊髓发育关键阶段（HH 15-16, HH 19-20, HH 23-25）的表达图谱。整体原位杂交和免疫荧光结果显示，miR-219a在轴突跨越中线前的阶段（HH 15-16, HH 19-20）于脊髓背侧和轴突轨迹的同侧区域高表达，而cRobo1蛋白水平此时却很低。相反，cRobo1 mRNA在HH 19-20时已在轴突轨迹中有明显表达。到了后跨段（HH 23-25），miR-219a信号仍局限于前跨段轴突区域，而cRobo1蛋白则显著富集于后跨段轴突所在的侧索(Lateral Funiculus, LF)和腹索(Ventral Funiculus, VF)。这种时空上互补的表达模式强烈提示miR-219a可能负调控cRobo1的蛋白表达。

为了证实miR-219a直接靶向cRobo1，研究团队进行了双荧光素酶报告基因实验。他们将包含野生型或突变型miR-219a结合位点(MicroRNA Recognition Element, MRE)的cRobo1 3'UTR克隆至报告基因下游，与miR-219a模拟物共转染HeLa细胞。结果发现，miR-219a可显著抑制携带野生型cRobo1 3'UTR的报告基因活性，而对结合位点突变的3'UTR则无此效应，证明了结合的特异性。在鸡胚脊髓中过表达miR-219a，能显著降低内源性cRobo1蛋白水平，但不影响其mRNA水平，表明miR-219a主要通过翻译抑制而非mRNA降解来调控cRobo1。

那么，内源性的miR-219a在发育脊髓中是否确实具有功能活性？研究人员设计了一种双荧光传感器质粒，其中Venus YFP的3'UTR后包含多个miR-219a的MRE。将其电转入鸡胚神经管后，发现与对照传感器相比，miR-219a传感器组的YFP/RFP比值在脊髓前跨段区域显著降低，说明内源性miR-219a是活跃的。使用anti-miR-219a寡核苷酸抑制miR-219a功能后，这种抑制效应被解除，进一步验证了其活性与特异性。更有趣的是，利用光转换蛋白kikGR与cRobo1 3'UTR融合的报告系统进行局部蛋白翻译实验发现，在分离的轴突中，miR-219a的活性抑制了报告蛋白的局部合成；而当使用anti-miR-219a或miR-219a靶点保护剂(Target Protector, TP)阻断miR-219a与cRobo1 3'UTR的结合后，轴突内报告蛋白的合成得以恢复。这直接证明了miR-219a能在轴突水平局部调控cRobo1的蛋白翻译。

功能上的重要性如何体现？研究人员进行了经典的轴突转向实验。他们发现，在鸡胚半脊髓外植体培养体系中，干扰内源性miR-219a功能（通过表达miR-219a“海绵”Sponge）或表达对miR-219a不敏感的cRobo1突变体（其3'UTR的MRE被突变），会导致前跨段轴突对Slit2分泌细胞团产生本不应有的排斥反应。相反，表达对miR-219a敏感的野生型cRobo1则不会引起过早排斥。这表明破坏miR-219a-cRobo1轴会使得前跨段轴突过早获得对Slit的敏感性。

体内的表型分析进一步支持了这一结论。在鸡胚脊髓中干扰miR-219a功能（表达Sponge或TP）或表达miR-219a不敏感的cRobo1，会导致大量连合轴突在抵达中线前停滞或投射路径异常。而在后跨段过表达miR-219a，则会因cRobo1蛋白水平下调导致轴突在底板内停滞，类似于Robo1敲除的表型。这些体内外实验一致表明，miR-219a通过抑制cRobo1翻译，是确保连合轴突正常导向和中线跨越所必需的。

最后，一个关键问题是，这一机制是否保守存在于哺乳动物中？研究人员将目光转向小鼠模型。生物信息学分析显示，小鼠miR-219a(mmu-miR-219a)同样预测靶向小鼠Robo1(mRobo1)的3'UTR，且双荧光素酶实验证实了mmu-miR-219a可抑制mRobo1 3'UTR报告基因活性。原位杂交显示mmu-miR-219a在胚胎期10.5天(E10.5)的小鼠脊髓背侧和轴突轨迹中高表达。为了研究其生理功能，他们构建了连合神经元特异性敲除小鼠模型：利用在脊髓背侧神经元（包括CNs）中特异性表达的Wnt1-Cre，与miR-219a-1和miR-219a-2双floxed小鼠交配，获得CNs中miR-219a条件性双敲除(Double Knockout, DKO)小鼠。

对E11.5 DKO小鼠胚胎脊髓的分析揭示了显著的连合轴突导向缺陷：与野生型相比，DKO组中有更多轴突在抵达底板前停滞，腹侧连合(Ventral Commissure)高度减小。更重要的是，免疫荧光显示DKO小鼠脊髓的多个区域（包括dI1区、侧索、腹索、腹侧连合和轴突轨迹）的mRobo1蛋白水平显著升高。这直接证明了内源性miR-219a在小鼠体内同样负调控mRobo1蛋白表达，其缺失会导致Robo1上调进而引起轴突导向错误。

本研究主要运用了以下关键技术方法：通过鸡胚子宫内电穿孔进行基因操作；利用荧光激活细胞分选术分离特定神经元群体；采用小RNA测序进行miRNA表达谱分析；通过双荧光素酶报告基因实验验证miRNA与靶基因3'UTR的直接相互作用；运用整体原位杂交和免疫组织化学进行时空表达分析；采用双荧光报告系统和光转换蛋白kikGR进行体内3'UTR活性和局部蛋白翻译监测；利用半脊髓外植体与细胞团共培养进行轴突转向分析；以及构建并分析组织特异性基因敲除小鼠模型（小鼠样本通过遗传交配获得）。

研究结果总结

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  miR-219a在鸡脊髓发育中的鉴定与表达特征：通过dI1 CNs的miRNA测序，鉴定出miR-219a为cRobo1的潜在调控因子。其表达呈现时空特异性，在前跨段CNs和CA轨迹中高表达，与cRobo1蛋白表达呈互补模式。
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  miR-219a直接靶向并抑制cRobo1表达：双荧光素酶报告基因实验证实miR-219a通过其MRE特异性结合cRobo1 3'UTR并抑制报告基因活性。在鸡胚脊髓中过表达miR-219a可降低内源性cRobo1蛋白水平，但不影响mRNA，表明为翻译抑制。
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  内源性miR-219a的活性与局部翻译调控：利用双荧光传感器和kikGR局部翻译实验，证明内源性miR-219a在发育脊髓中具有活性，并能特异性抑制其靶标在轴突水平的局部蛋白合成。
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  miR-219a-cRobo1轴调控Slit响应性：功能实验表明，破坏miR-219a对cRobo1的调控（通过Sponge或MRE突变体）会使前跨段CA对Slit2产生过早的排斥反应。
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  miR-219a对鸡脊髓CA体内投射至关重要：表型分析显示，干扰miR-219a-cRobo1轴会导致CA在抵达中线或底板前出现停滞、转向等导向缺陷。
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  miR-219a-Robo1轴在小鼠模型中保守：证实mmu-miR-219a可调控mRobo1 3'UTR。CNs特异性敲除miR-219a的小鼠表现出mRobo1蛋白上调以及CA导向缺陷，表明该机制在哺乳动物中保守。

结论与意义

本研究系统性地揭示了一个由高度保守的miR-219a介导的、通过翻译水平精细调控Robo1受体表达的新机制，该机制是Slit/Robo1信号通路正确调控脊椎动物脊髓连合轴突导向和中线跨越的关键环节。该“miR-219a-Robo1轴”作为分子开关，通过维持前跨段轴突低水平的Robo1蛋白，确保其对中线Slit信号不敏感，从而允许轴突顺利穿越；而在后跨段，该抑制的解除则有助于Robo1蛋白上调，使轴突获得排斥性以离开中线。这项工作不仅深化了我们对轴突导向分子机制的理解，将转录后调控，特别是miRNA介导的局部翻译控制，置于神经环路发育精密调控的核心位置，而且提示类似的机制可能广泛存在于神经系统其他区域的轴突导向过程中。此外，鉴于Slit-Robo信号在癌症转移、视网膜血管疾病及神经发育障碍等多种病理过程中的作用，对miR-219a-Robo1轴功能的阐明也可能为相关疾病的机制研究与治疗策略开发提供新的视角和潜在靶点。