古老肽酶被"征用"调控多细胞蓝细菌发育模式的新机制

《iScience》：Co-option of an ancestral peptidase controls developmental patterning in multicellular cyanobacteria

本研究揭示了多细胞蓝细菌发育模式形成的关键机制：研究人员发现古老肽酶PatP通过切割PatX产生HRGTGR六肽，直接抑制主调控因子HetR的活性，从而控制异形胞的空间分布模式。该研究阐明了图灵模式系统中扩散性抑制子的成熟过程，为多细胞生物模式进化提供了重要见解。

　　

在生命演化的长河中，多细胞生物如何从简单的细胞聚集发展出精确的空间模式，一直是发育生物学领域的核心谜题。20世纪50年代，数学家艾伦·图灵提出的反应-扩散模型为这一现象提供了理论框架，认为生物模式的形成源于具有不同扩散速率的组分之间的相互作用。然而，这一理论中的关键环节——扩散性抑制因子的成熟机制——长期以来仍笼罩在神秘面纱之下。

蓝细菌作为地球上最早进行产氧光合作用的生物类群，为研究多细胞模式形成提供了独特模型。在多变氮源的环境中，某些丝状蓝细菌如Nostoc PCC 7120演化出了惊人的生存策略：当环境中缺乏结合氮时，约10%的细胞会分化为专门固氮的异形胞，这些特化细胞能够创造低氧微环境，容纳对氧敏感的固氮酶复合体。更令人惊叹的是，新生异形胞总是在现有异形胞中间位置形成，维持着每10-12个营养细胞间隔一个异形胞的精确空间模式。

这种精妙的模式是如何建立和维持的？科学家们早已知道，主调控因子HetR在异形胞分化中起核心作用，而小肽PatS和HetN通过产生RGSGR基序抑制HetR活性，符合局部激活-长程抑制的图灵模型。然而，patS和hetN基因并非在所有异形胞形成菌中保守存在，暗示着还有其他抑制因子参与这一过程。

近年来，研究人员发现了第三个关键玩家——PatX，它含有一个保守的HRGTGR六肽基序，且与HetR在丝状蓝细菌中共同出现。更引人注目的是，系统发育分析表明PatX/HetR对在多细胞蓝细菌中的出现早于PatS和HetN，甚至早于异形胞发育的演化，提示它们可能在蓝细菌多细胞性的早期阶段就发挥了重要作用。但是，PatX的分子作用机制及其活性形式的产生过程始终是个未解之谜。

Xu Xiaomei等研究团队在《iScience》上发表的最新研究，终于揭开了这一谜题的关键环节。他们发现，PatX需要被转运到周质空间，由一个古老肽酶PatP（原名Alr1666）切割加工，释放出具有活性的HRGTGR六肽，该六肽能够直接结合并抑制HetR的DNA结合活性，从而阻断异形胞分化。

关键技术方法概述

研究团队运用了多种关键技术：通过马尔他糖结合蛋白（MBP）定位实验验证蛋白质转运；利用异硫氰酸荧光素滴定（ITC）和电泳迁移率变动分析（EMSA）检测蛋白-肽相互作用；采用CRISPR-Cpf1基因编辑技术构建突变体；通过定量实时PCR（qRT-PCR）和GFP报告系统分析基因表达；使用体外切割实验和质谱分析鉴定蛋白酶活性；开展大规模基因组比较分析追溯基因进化历程。

PatX直接抑制HetR活性调控Nostoc异形胞形成

研究人员首先探究了PatX是否像PatS一样通过抑制HetR活性来发挥作用。细菌双杂交实验显示，去除信号肽的PatX（PatX△SS）与HetR之间没有直接相互作用。然而，ITC实验表明PatX衍生的HRGTGR六肽（PatX6）能够紧密结合HetR，解离常数（K_d）约为88 nM。

EMSA实验进一步证实，无论是PatS6还是PatX6，都能有效抑制HetR与其靶基因hetP启动子的结合。体内实验也支持这一结论：patX过表达会阻断异形胞形成，但与已知的免疫蛋白hetL共表达时，这种抑制效应被逆转，即使在抑制条件下也能恢复分化能力。

PatX的胞外转运对其活性至关重要

PatX蛋白N端含有两个预测的Sec型信号肽。研究人员将这两个信号肽分别融合到缺乏自身信号肽的MBP上，在大肠杆菌中进行的MBP定位实验表明，两个信号肽都能指导蛋白质成功转运至周质空间。在Nostoc中，去除信号肽的patX△SS过表达只能微弱抑制异形胞分化（分化频率为7%），而全长patX过表达则完全抑制分化，证明PatX必须被转运至胞外才能发挥功能。

鉴定Nostoc中参与PatX成熟的潜在肽酶

基于PatX需要在胞外加工的假设，研究人员筛选了Nostoc基因组中预测为胞外定位的肽酶。从MEROPS数据库中筛选出的八个候选蛋白中，Alr1666和All2656因功能未知而被选为重点研究对象。两者的信号肽均能在大肠杆菌中指导MBP的周质定位。

基因表达分析显示，氮剥夺后8小时，alr1666转录水平上升约7倍，与patX的诱导表达（3倍）同步，而all2656表达水平不变。启动子- GFP融合实验表明，Palr1666在营养细胞中表达较强，而在异形胞中表达较低，提示其可能参与异形胞模式调控。

确立Alr1666（PatP）为PatX成熟的关键肽酶

为了验证这些肽酶在PatX成熟中的作用，研究人员利用CRISPR-Cpf1技术构建了△all2656和△alr1666突变体。在patS突变背景下，△patS△alr1666双突变体表现出过度分化现象（48小时异形胞频率达37%），并出现坏死细胞，表型与已知的patS patX双突变体相似，而△patS△all2656则与△patS单突变体无显著差异。

PatP与PatX共定位对PatX加工和分化抑制至关重要

一项巧妙的遗传学实验为PatP加工PatX提供了进一步证据：胞内表达的PatX△SS无法抑制分化，但当与胞内表达的Alr1666△SS共表达时，分化被完全抑制，证明Alr1666能够在胞内加工PatX产生抑制信号。

定位研究显示，PatP信号肽-sfGFP融合蛋白在细胞周边形成荧光环，特别是在细胞连接处，表明其周质定位。虽然全长PatX-sfGFP主要位于胞质，但这可能是由于sfGFP的快速折叠阻碍了转运，而信号肽功能在大肠杆菌中的验证支持其在Nostoc中的周质定位假说。

体外切割实验证实Alr1666为PatX特异性肽酶

研究人员建立了双表达系统来验证Alr1666介导的PatX切割。将TrxA-PatX△SS-MBP融合蛋白与Alr1666△SS-V5共表达，Western blot分析显示，仅在Alr1666表达时出现约18 kDa的切割产物条带。质谱分析进一步鉴定出两个独特的非胰蛋白酶肽段（AFSPSNSQNMISLK和GPDIIFWAHDR），它们位于HRGTGR抑制肽两侧，且仅在肽酶表达样本中检测到，为Alr1666特异性切割PatX提供了确凿证据。

PatP-patX-hetR的系统发育共进化定义了念珠藻目-颤藻目支系并揭示古老的patP早于patX和hetR

大规模基因组分析揭示了这些组件在蓝细菌界的演化轨迹。在474个蓝细菌基因组中，patP分布广泛（86.2%基因组含有），而patX和hetR分布受限但高度重叠，主要共存于丝状蓝细菌的念珠藻目（Nostocales）和颤藻目（Oscillatoriales）。

三种主要的基因存在模式中，0100模式（仅含patP）主要存在于微囊藻（Microcystis aeruginosa）等单细胞菌株中，而0111模式（patP+hetR+patX）和1111模式（all2656+patP+hetR+patX）则特异性地存在于念珠藻目和颤藻目等丝状蓝细菌中。这表明PatP作为古老的肽酶，其与PatX和HetR的功能耦合是丝状蓝细菌的特有特征。

研究结论与意义

该研究揭示了多细胞生物模式形成的一种新型分子机制：一个古老的肽酶如何被"征用"来处理新的信号肽，将简单的蛋白水解事件转化为复杂的发育模式指令。

PatP在蓝细菌中广泛存在，甚至在单细胞物种中也有分布，提示其最初可能参与细胞壁重塑、环境适应或生态位竞争等基础过程。随着丝状蓝细菌的演化，patX和hetR基因出现，PatP被招募来处理这一新的信号肽，最初可能用于调控丝状生长（如通过坏死细胞形成）。在异形胞形成菌中，这一系统被进一步特化，用于控制异形胞的空间分布模式。

这一演化轨迹与后生动物信号通路有惊人相似之处。如在Notch信号系统中，配体位于信号发送细胞的膜上，与接收细胞上的NOTCH受体结合，触发蛋白水解级联反应；BMP（骨形态发生蛋白）信号中，Tolloid金属蛋白酶切割分泌性拮抗剂Chordin/Sog，释放BMP抑制并形成梯度分布的模式形成信号。蓝细菌与后生动物虽然相隔亿万年的演化历程，却殊途同归地通过"征用"古老蛋白酶来切割谱系特异性配体，创造空间分辨的发育指令。

该研究不仅阐明了蓝细菌异形胞模式形成的关键环节，更重要的是揭示了多细胞性演化的一条普适性原则：复杂模式的形成可以通过重新利用现有的分子组件来实现，而非总是需要发明全新的遗传元件。这种"演化经济性"原则可能普遍存在于多细胞生命的起源过程中，为理解生命从简单到复杂的跃迁提供了重要启示。