细菌厌氧生长新机制：核糖体RNA低氧诱导修饰激活肽酰转移酶中心

《Molecular Cell》：Hypoxia-induced ribosomal RNA modifications in the peptidyl-transferase center contribute to anaerobic growth of bacteria

本刊推荐一项由东京大学Suzuki团队主导的突破性研究。为解决细菌在缺氧环境下如何调控翻译效率这一科学问题，研究人员开展了关于核糖体RNA修饰在肽酰转移酶中心（PTC）动态调控机制的研究。研究发现大肠杆菌在厌氧条件下通过RImX酶介导的5'(S)-核糖甲基化（D5Sm2449和Cm5Sm2498）和RIhA介导的ho5C2501羟基化共同稳定PTC结构，显著提升肽键形成效率和蛋白质合成能力。该发现首次揭示了细菌通过表观转录组层面调控核糖体功能适应低氧环境的新机制，为抗菌药物研发提供了新靶点。

　　

在自然界中，细菌需要不断应对氧气浓度变化的环境挑战。当氧气供应受限时，大肠杆菌等微生物会启动复杂的适应机制来维持生存。传统观点认为，细菌主要通过调控基因表达和代谢通路来适应缺氧环境，然而近年来研究发现，核糖体作为蛋白质合成的核心机器，其本身也存在着精细的功能调控机制。核糖体RNA（rRNA）上的化学修饰可能扮演着关键角色，但这一领域的研究长期以来存在空白。

特别是在肽酰转移酶中心（PTC）——核糖体催化肽键形成的活性区域，已知存在多种rRNA修饰，然而这些修饰在不同氧气条件下的动态变化及其功能意义尚未明确。理解细菌在缺氧条件下如何通过rRNA修饰优化翻译效率，不仅能够揭示微生物适应环境的新机制，还可能为开发新型抗菌策略提供思路。

在这项发表于《Molecular Cell》的研究中，东京大学工程研究生院化学与生物技术系的Kensuke Ishiguro等研究人员系统探讨了低氧诱导的rRNA修饰对细菌厌氧生长的贡献。研究团队发现，在大肠杆菌厌氧培养条件下，23S rRNA的PTC区域出现了三种特异性修饰的上调：D5Sm2449（5'(S)-甲基二氢尿苷）、Cm5Sm2498（2'-O-5'(S)-二甲基胞苷）和ho5C2501（5-羟基胞苷）。这些修饰共同构成了一个精细的调控网络，显著提升核糖体的翻译活性。

研究人员首先通过液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）比较了需氧和厌氧条件下大肠杆菌rRNA的修饰状态，发现这三个修饰在厌氧条件下显著增加。随后利用核磁共振（NMR）等技术精确解析了D5Sm和Cm5Sm的化学结构，确认甲基化发生在核糖的5'(S)位置，这是一种前所未有的RNA骨架修饰类型。

为了阐明这些修饰的生物学功能，研究团队通过基因敲除、体外重构、冷冻电镜结构分析等多技术手段，揭示了完整的调控通路。研究发现，RImX（一种钴胺素依赖的自由基S-腺苷甲硫氨酸甲基转移酶）负责催化D5Sm2449和Cm5Sm2498的形成，而该酶的活性受到氧气浓度的严格调控。在厌氧条件下，RImX表达上调且其[4Fe-4S]簇对氧敏感的特性使其活性增强，从而导致5'(S)-甲基化水平升高。

关键技术方法包括：通过基因敲除菌株构建验证修饰酶功能；利用体外酶活重构系统分析RImX的催化机制；采用毛细管LC-nano ESI-MS进行精确的RNA修饰定量；运用冷冻电镜解析核糖体高分辨率结构（分辨率达2.6-2.7?）；通过体外翻译系统和肽酰转移酶活性测定评估修饰的功能效应。

缺氧诱导rRNA修饰的鉴定

研究人员首先分离了23S rRNA的PTC区域片段，通过RNA-MS分析发现，在厌氧条件下，D2449和Cm2498位点的甲基化程度显著增加，同时ho5C2501的修饰频率也从51%升至89%。这表明这三个修饰构成了一个低氧特异性的修饰签名。

化学结构解析

通过NMR和LC-MS联用技术，团队精确确定了D5Sm2449和Cm5Sm2498的化学结构。研究发现5'(S)-甲基化会改变核糖的构象平衡，使U5Sm在C2'-endo和C3'-endo构象间以近似比例存在，这种构象变化可能影响PTC的结构动力学。

RImX酶的鉴定与表征

通过基因筛选，研究团队发现ygiQ（命名为rlmX）编码的甲基转移酶负责催化这两个5'(S)-甲基化反应。序列分析显示RImX属于钴胺素依赖的自由基SAM酶家族，包含钴胺素结合域、自由基SAM域和DUF3362域。点突变实验证实，该酶的[4Fe-4S]簇结合位点（C386、C390、C393）和钴胺素结合模体（G160）对其催化活性至关重要。

体外重构与反应机制

研究成功在体外重构了RImX催化的甲基化反应，发现该反应需要甲基钴胺素（Me-Cbl）、S-腺苷甲硫氨酸（SAM）和甲基紫精（MV）作为电子载体。同位素标记实验证实甲基供体来源于SAM。值得注意的是，RImX只能以未组装的23S rRNA为底物，表明这些修饰发生在核糖体组装的早期阶段。

生理功能验证

基因敲除实验显示，rlmX和rlhA双敲除菌株在厌氧条件下生长显著受损，而单独敲除任一基因影响较小。体外翻译实验表明，来自双敲除菌株的核糖体蛋白质合成活性降低约50%，肽酰转移酶活性降至野生型的64%，证实这些修饰对维持高效翻译的重要性。

结构基础阐释

通过高分辨率冷冻电镜结构分析（2.6-2.7?），研究揭示了这些修饰稳定PTC的分子机制。D5Sm2449的5'(S)-甲基与Gm2251的C4'和C5'碳形成范德华相互作用，而ho5C2501的5-OH通过水分子与D5Sm2449的2'OH和G2446的N3形成氢键网络，这些相互作用共同增强了PTC的结构稳定性，减少了催化过程中的构象波动。

研究结论表明，细菌通过低氧诱导的rRNA修饰动态调控核糖体功能是一种进化上保守的适应策略。在能量有限的厌氧环境下，细菌通过提升单个核糖体的催化效率来补偿核糖体数量的减少，实现能量利用最优化。这一发现不仅拓展了表观转录组学的范畴，揭示了首例5'(S)-核糖甲基化修饰，还为理解细菌环境适应机制提供了新视角。从应用角度，该研究为开发针对核糖体修饰酶的新型抗菌药物提供了理论依据，同时提示在厌氧条件下制备的核糖体可能更适合用于体外蛋白质生产系统。