结构快照揭示溶酶体核酸外切酶PLD3和PLD4降解单链DNA的分子机制

《Nature Communications》：Mechanistic insights into single-stranded DNA degradation by lysosomal exonucleases PLD3 and PLD4 from structural snapshots

本研究针对溶酶体核酸外切酶PLD3和PLD4如何特异性降解单链核酸并调控TLR信号通路的分子机制尚不明确的问题，通过单颗粒冷冻电镜技术解析了PLD3/PLD4与底物结合的多状态结构。研究揭示了酶通过Phe335环构象变化动态重塑底物结合口袋的机制，捕获了底物重排的亚稳态，并鉴定了导致PLD3/PLD4活性差异的关键残基，为自身免疫病和神经退行性疾病的靶向治疗提供了新见解。

　　

在生命体中，核酸（NAs）作为遗传信息的载体至关重要，但外源核酸及其代谢产物同样在宿主防御免疫中扮演关键角色。病原核酸可被内体区室的Toll样受体（TLR）3、7-9、13以及胞质中的视黄酸诱导基因-I（RIG-I）样受体和环GMP-AMP合酶（cGAS）等传感器识别，进而触发NF-κB和IRF信号通路，诱导细胞因子和I型干扰素产生，促进炎症和抗病毒反应。核酸酶通过限制核酸可用性或产生激活配体，在调节先天免疫中发挥着不可或缺的作用。然而，不同传感器可识别双链RNA（dsRNA）、双链DNA（dsDNA）、核糖体RNA或DNA/RNA降解产物，这使得核酸酶介导的调控变得复杂。

磷脂酶D（PLD）家族成员PLD3和PLD4是内溶酶体核酸外切酶，能够降解单链DNA（ssDNA）或单链RNA（ssRNA），从而调节TLR7或TLR9的应答。全基因组关联研究显示，PLD4多态性与系统性红斑狼疮、系统性硬化症和类风湿关节炎等自身免疫性疾病相关，而PLD3多态性则与阿尔茨海默病、脊髓小脑性共济失调和脑白质病综合征等神经退行性疾病相关。反映这种不同的疾病关联，PLD4主要在免疫细胞中有限表达，而PLD3则在各种组织中普遍表达。近期研究发现，PLD3能降解神经元细胞溶酶体中的线粒体DNA（mtDNA），其功能失调可能导致mtDNA泄漏至胞质，激活cGAS-STING相关的自噬，暗示其与APP代谢的潜在联系。

尽管PLD3和PLD4的晶体结构已有报道，揭示了其 luminal 结构域的整体结构和由螺旋间相互作用介导的二聚体组织，但关于底物识别、特异性以及外切酶机制的了解仍然有限，主要是由于先前研究中底物或含有磷酸组氨酸中间体的ssDNA产物结合形式的电子密度不足。为了深入理解PLD3和PLD4降解ssDNA的分子机制，来自东京大学的研究团队在《Nature Communications》上发表了题为“Mechanistic insights into single-stranded DNA degradation by lysosomal exonucleases PLD3 and PLD4 from structural snapshots”的研究论文。

研究人员主要运用了以下关键技术方法：利用哺乳动物细胞（Expi293F）表达并纯化人源PLD3和PLD4的 luminal 结构域；通过电泳迁移变动实验（EMSA）筛选蛋白质与底物形成稳定复合物的条件；采用单颗粒冷冻电镜（cryo-EM）技术解析了PLD3结合不同底物（poly(T)和poly(A)）以及PLD4结合poly(T)底物等多种状态的高分辨率结构；通过终点标记荧光淬灭寡核苷酸（EFQO）分析和凝胶为基础的核酸酶活性测定评估突变体的外切酶活性；利用基于细胞的TLR9报告基因实验验证PLD3突变体在调节TLR9信号通路中的功能重要性。

结构基础揭示PLD3的底物识别机制

研究人员首先发现，酸性条件（pH 5.5或更低）能增强PLD3与其底物的相互作用。他们成功解析了人PLD3催化双突变体（H201A/H416A, hPLD3_HA）结合不同底物（poly(T)和poly(A)）的冷冻电镜结构，分辨率达2.9 ?，同时还解析了野生型PLD3（hPLD3_apo）和PLD4（hPLD4_apo及其结合poly(T)）的结构。PLD3形成同源二聚体，每个原体由具有α/β水解酶折叠的HKD1和HKE2结构域组成。保守的HKD/E motif中的His和Lys残基（HKD1中的His²⁰¹和Lys²⁰³，HKE2中的His⁴¹⁶和Lys⁴¹⁸）相对排列形成催化位点。

结构分析显示，底物以几乎垂直的方式进入一个狭窄且深的、带负电荷表面的催化空腔，其主链在5'端和第二个核苷酸之间发生急剧弯曲，形成L形构象。这种构象使得5'端核苷酸的糖磷酸骨架朝向内，而碱基部分朝外，便于切割产物3'-磷酸单核苷酸的释放。在hPLD3_poly(T)结构中，5'端的四个核苷酸（dT1-dT4）被清晰解析，前三个核苷酸容纳在催化空腔内，第四个核苷酸则位于空腔口。5'端dT1的3'-磷酸基团与Lys²⁰³、Asn²¹⁸、Lys⁴¹⁸和Asn⁴³²相互作用，其碱基与Tyr⁴¹¹发生π-π堆积。dT2的3'-磷酸与Asn³²⁸、Trp³⁶⁷和Tyr⁴³⁷相互作用，dT3的3'-磷酸与His³⁶⁹和Arg⁴⁸⁸相互作用。dT2、dT3的碱基与Phe³³⁵依次形成π-π堆积网络。

引人注目的是，在hPLD3_poly(A)结构中，dA3的碱基朝向相对于dA2发生了翻转。这使得dA2的碱基直接与Phe³³⁵形成芳香环堆积作用，而翻转的dA3则与His³⁶⁹发生堆积。这种构象差异表明PLD3通过Phe³³⁵所含环的运动，以不同的方式识别嘌呤和嘧啶碱基。酶活分析也证实PLD3对poly(T)的外切酶活性高于poly(A)，提示其具有序列偏好性。

PLD3底物识别关键残基的功能验证

为了验证与底物相互作用残基的功能重要性，研究人员进行了终点标记荧光淬灭寡核苷酸（EFQO）分析，监测PLD3对作为TLR9配体的CpG ODN（ODN1668）的降解活性。他们突变了与催化反应（His²⁰¹/His⁴¹⁶、Glu²²⁹）、磷酸基团相互作用（Lys²⁰³、Asn³²⁸、Trp³⁶⁷、His³⁶⁹、Lys⁴¹⁸、Tyr⁴³⁷）以及π-π堆积相互作用（Phe³³⁵、Tyr⁴¹¹）相关的残基。所有突变体均降低了酶活性，支持了磷酸介导和π-π堆积相互作用在底物识别中的重要性。在细胞水平，过表达野生型PLD3能减弱TLR9依赖的NF-κB激活，而K203A、E229A、H369A或K418A突变体则使反应恢复至接近对照水平，进一步证实了PLD3外切酶活性在调节TLR9信号通路中的重要性。

结构比较鉴定PLD3与PLD4活性差异的关键残基

研究证实PLD3表现出比PLD4更高的外切酶活性。尽管PLD3和PLD4的结构整体相似，但序列比对显示PLD3中与底物3'-磷酸相互作用的几个残基（Asn³²⁸、His³⁶⁹、Arg⁴⁸⁸）在PLD4中对应为Glu³⁴¹、Asn³⁸²和Val⁵⁰³。功能实验表明，PLD4的E341N突变可能消除了与第二个核苷酸3'-磷酸的静电排斥，而V503R突变可能增强与第三个核苷酸3'-磷酸的相互作用。PLD4 E341N突变体的活性高于野生型，E341N/V503R双突变体活性显著增加，甚至在中性pH（7.0）下仍保留活性。相反，PLD3的N328E突变（预计会引起与第二个核苷酸3'-磷酸的静电排斥）活性降低。这些结果表明这些序列差异导致了PLD3和PLD4外切酶活性的不同。

PLD4结构揭示底物的动态性质

在存在poly(T)底物的PLD4四聚体的冷冻电镜图中，在一个二聚体的两个催化位点观察到了poly(T)分子，但在另一个二聚体中相应的密度则模糊不清。有趣的是，两个PLD4原体中的poly(T)密度不同。研究人员在一个原体中建模了两个不连接的3'-磷酸dT核苷酸（产物结合形式），在另一个原体中建模了连接的三个dT核苷酸（底物结合形式）。在产物结合的PLD4中，一个3'-磷酸dT通过其3'磷酸基团与保守HKD/E motif中的His²¹⁴、Lys²¹⁶、His⁴²⁸和Lys⁴³⁰形成盐桥，其碱基部分通过π-π堆积作用夹在Phe⁴²³和Leu¹⁸³之间。新生成的底物5'端位于产物相邻位置，其5'羟基面向产物dT 3'-磷酸的5'羟基。

在底物结合的PLD4中，dT1同样被夹在Phe⁴²³和Leu¹⁸³之间，但其3'磷酸基团远离催化残基。His²¹⁴与dT1的3'-磷酸形成盐桥，但Lys²¹⁶、His⁴²⁸或Lys⁴³⁰的侧链距离dT1的3'-磷酸基团超过5.5 ?。相反，Tyr⁴⁴⁹的酚羟基与dT1的3'磷酸形成分叉氢键，有助于底物结合。dT2夹在Val²¹²和Phe³⁴⁸之间，dT3堆叠在Phe³⁴⁸上。这些观察强烈表明，观察到的底物结合PLD4代表了一个亚稳态而非底物切割状态，反映了PLD4初始消化后底物重排过程中的瞬时中间体。

从结构快照重建催化动力学

研究人员对hPLD3_apo、hPLD3_poly(T)、hPLD3_poly(A)、小鼠PLD3磷酸组氨酸中间体形式、小鼠PLD3磷酸结合形式以及人PLD3产物结合形式进行了结构比较，以深入了解催化机制。催化残基以及与底物相互作用的残基的构象在人和小鼠之间以及各种催化状态之间是保守的。催化残基His⁴¹⁶（人） / His⁴¹⁴（鼠）仅在mPLD3中间体和产物结合hPLD3中发生旋转构象转变，朝向His²⁰¹（人）/ His¹⁹⁹（鼠）移动。与第一个核苷酸碱基堆叠的Tyr⁴¹¹（人）/ Tyr⁴⁰⁹（鼠）表现出结构变异性。与第二个或第三个核苷酸碱基堆叠的Phe³³⁵（人）/ Phe³³³（鼠）发生构象变化。结合底物（poly(T)或poly(A)）的第一个核苷酸在PLD3_poly(T)/poly(A)中占据与产物结合hPLD3相同的位置，其磷酸基团与mPLD3中间体很好地对齐。

hPLD3_poly(T)与产物结合hPLD4的结构比较揭示了与底物切割相关的构象变化。产物的3'-磷酸基团大致保持在相同位置，而产物的5'-OH基团由于切割后核糖环翻转移动了8.1 ?。伴随此变化，新生成5'端核苷酸的磷酸基团向外位移（约6.9 ?）以避免与产物的5'-OH基团发生空间冲突。相反，底物结合hPLD4与hPLD3_poly(T)的结构比较揭示了向底物切割状态转变相关的构象变化。PLD4复合物中dT1或dT2的3'-磷酸分别相对于PLD3复合物位移了4.8 ?或7.9 ?，而dT1或dT2的碱基部分由于与Phe⁴²³或Phe³⁴⁸的π-π堆积作用几乎保持正确对齐，提示碱基部分可能作为引导磷酸基团进入正确位置的结构支架。

研究结论与意义

本研究通过解析PLD3和PLD4与底物结合前的复合物结构，成功捕捉了切割前的状态，揭示了结合口袋根据底物发生变化的特性。通过成功捕获其他状态，研究人员提出了PLD3和PLD4酶循环的综合模型。在该循环中，除了Phe³³⁵环外，蛋白质仅发生微小的构象变化；切割后，结合的底物通过产物和剩余底物的协调运动重新定位到适合进一步切割的构象。

该研究对底物识别和催化的结构细节提供了重要见解。与PLD家族中大多数具有大催化空腔、允许寡核苷酸沿蛋白表面滑动的核酸酶（如Nuc TDP1）不同，PLD3和PLD4的催化空腔使得寡核苷酸几乎垂直进入，底物在5'端和第二个核苷酸之间的磷酸二酯键处弯曲成L形，这种构象对产物释放似乎很重要。PLD3和PLD4的这种底物捕获机制在已知核酸酶中是独特的。

研究还表明，PLD3和PLD4识别底物5'端的前三到四个核苷酸，提示其底物特异性可能延伸至5'端更复杂的多核苷酸组合。结合不同底物的PLD3结构显示，每种底物在PLD3的催化空腔中采用独特的构象，并通过不同的相互作用与PLD3结合，表明PLD3（可能也包括PLD4）能根据底物序列灵活地重塑其催化口袋。

PLD3和PLD4不同的外切酶活性和底物特异性可能反映了它们不同的生理角色，这与PLD4多态性与自身免疫疾病相关而PLD3多态性与神经退行性疾病相关的观察一致。因此，它们底物结合口袋的独特特征可能作为开发选择性抑制剂或激活剂的有价值靶点。总之，这项研究提供了一系列结构快照，极大地扩展和深化了我们对PLD3和PLD4介导的ssDNA降解机制的理解，为相关疾病的治疗策略开发奠定了坚实的结构基础。