人源葡萄糖-6-磷酸转运蛋白结构解析揭示其通过反向转运机制驱动G6P与Pi交换的分子基础

《Nature Communications》：Structures of human glucose-6-phosphate transporter reveal reciprocal antiport mechanism driving glucose-6-phosphate and inorganic phosphate exchange

本研究针对葡萄糖-6-磷酸转运蛋白(G6PT1)在系统葡萄糖稳态中的关键作用及其缺陷导致的糖原贮积症1b型(GSD1b)的分子机制不明确这一科学问题，开展了人源G6PT1的结构与功能研究。研究人员通过单颗粒冷冻电镜技术解析了G6PT1的apo、Pi结合及GlcN6P结合状态的高分辨率结构，结合分子对接和功能实验，揭示了Pi梯度驱动G6P反向转运的分子机制，并发现二聚化对转运功能的重要调节作用。该研究为理解G6PT1的工作机制及其在GSD1b中的病理失调提供了结构基础，为开发靶向治疗策略提供了精准模板。

　　

在人体维持血糖稳定的精密调控网络中，内质网膜上的葡萄糖-6-磷酸转运蛋白1（G6PT1）扮演着至关重要的角色。它负责将细胞质中的葡萄糖-6-磷酸（G6P）转运至内质网腔内，由葡萄糖-6-磷酸酶（G6Pase）将其水解为葡萄糖和无机磷酸（Pi），葡萄糖随后被释放到血液中以供全身使用。这一过程在饥饿状态下防止低血糖的发生至关重要。G6PT1的功能缺陷会导致一种名为糖原贮积症1b型（GSD1b）的罕见遗传病，患者表现为空腹低血糖、肝肿大、中性粒细胞减少及免疫功能受损等严重症状。尽管G6PT1的生理重要性早已明确，但其如何特异性识别底物G6P和Pi，以及如何利用Pi的浓度梯度驱动G6P反向转运的分子机制，数十年来一直是个未解之谜。

为了回答这些关键问题，由武汉大学和清华大学的研究人员共同完成的一项研究，成功解析了人源G6PT1的高分辨率结构，揭示了其独特的工作机制。这项发表在《Nature Communications》上的研究，综合运用了结构生物学、生物化学和计算生物学等方法，为我们理解这一关键转运蛋白的功能及其相关疾病的病理基础提供了前所未有的见解。

研究人员主要运用了几项关键技术：利用HEK293F悬浮细胞系统表达重组人源G6PT1蛋白；采用单颗粒冷冻电镜技术解析蛋白结构，并使用了BRIL融合蛋白和Fab抗体辅助的策略以提高小分子量膜蛋白的分辨率；通过基于蛋白脂质体的转运实验评估G6PT1的转运活性；利用光谱位移分析法测定底物结合亲和力；并进行分子对接模拟以分析底物结合模式。

底物选择性和人源G6PT1的整体冷冻电镜结构

研究首先通过光谱位移分析评估了G6PT1的底物选择性，发现G6PT1对末端带有磷酸基团的糖磷酸酯（如G6P、葡萄糖胺-6-磷酸GlcN6P）具有优先结合能力。随后，研究人员利用冷冻电镜解析了G6PT1在不同状态下的结构。他们成功解析了apo状态（无底物）、Pi结合状态以及G6P类似物GlcN6P结合状态的结构，分辨率最高达到2.89 ?。所有结构均呈现典型的MFS（主要协助超家族）折叠特征，由12个跨膜螺旋组成N端和C端结构域，形成向细胞质开放的中央空腔。结构比对显示，人源G6PT1与大肠杆菌甘油-3-磷酸转运蛋白具有相似的架构。

G6PT1二聚体界面

有趣的是，研究发现G6PT1在膜环境中可以形成二聚体。结构分析表明，二聚化主要由两个原体的N端结构域介导，TM2、TM4和TM11上的疏水残基（如Phe51、Ile62、Pro101等）在二聚体界面中起关键作用。功能实验证实，破坏二聚体界面的点突变会显著损害G6P的转运活性，表明二聚化对G6PT1的功能具有重要的调节作用。

NTD中Pi结合的结构特征

G6PT1被表征为一种Pi连接的G6P反向转运蛋白。研究人员通过蛋白脂质体实验证实，G6P的转运依赖于预先建立的Pi梯度，反之，预载G6P或GlcN6P也能增强Pi的摄取，支持了反向交换机制。在Pi结合状态的结构中，研究人员在NTD的深部空腔内发现了两个相邻的球形密度，可能代表Pi的结合位点。这两个位点位于由Arg28、Lys29等进化上保守的带正电残基形成的微环境中。详细的配位分析揭示了Pi在转运循环中可能被稳定结合的分子基础。

G6PT1中G6P配位的结构基础

在GlcN6P结合状态的结构中，研究人员在中央空腔内观察到了额外的密度，可容纳一个GlcN6P分子。通过分子对接，他们进一步模拟了天然底物G6P的结合模式。结果表明，G6P的磷酸基团与GlcN6P的磷酸基团位置接近，而葡萄糖环则采取了一种偏移的构象。G6P与来自NTD和CTD的多个残基形成广泛的极性相互作用。关键残基的点突变功能实验证实了这些残基对G6P转运活性至关重要，特别是R28A、K29A和N374A突变几乎完全废除了G6P的摄取。

对apo、Pi结合和GlcN6P结合状态的比较结构分析为G6P/Pi反向转运循环提供了机制性见解。尽管三种结构均采用细胞质开放的构象，但Pi的结合会诱发局部构象变化，特别是促使TM1上的Lys29与TM7上的Asp245之间形成一个域间盐桥。这一相互作用与更厚的管腔侧门控和更紧凑的中央空腔相关，可能稳定了细胞质开放的构象，从而有利于后续G6P的结合。

该研究还讨论了G6PT1二聚体中两个原体是独立工作还是协同运作这一悬而未决的问题，为未来研究指明了方向。此外，研究指出目前G6PT1的调控剂非常稀缺，已报道的如绿原酸等天然产物结合力较弱。本研究获得的高分辨率结构为基于结构的药物筛选提供了精确的模板，对开发针对GSD1b、癌症和II型糖尿病的潜在疗法具有重要意义。

最后，研究团队将已报道的100多个GSD1b致病性SLC37A4突变映射到解析的G6PT1结构上，揭示了这些突变如何破坏底物转运孔、结构域界面、二聚体界面等关键功能基序，为理解疾病的分子病理和开发个性化治疗策略提供了结构框架。

综上所述，这项研究通过解析人源G6PT1的关键功能状态结构，结合严谨的功能验证，首次在原子水平揭示了Pi梯度驱动G6P反向转运的分子机制，并阐明了二聚化对功能的调节作用。这些发现不仅深化了我们对糖代谢核心环节的理解，也为攻克GSD1b等代谢疾病提供了坚实的科学基础。