小脑浦肯野细胞紧张性GABAA受体电流的发现及其在杜氏肌营养不良模型中的代偿性上调机制研究

《Scientific Reports》：Tonic GABAA receptor currents in Cerebellar Purkinje cells of wild-type and DMDmdx mice

本研究针对小脑浦肯野细胞（PC）中紧张性抑制（tonic inhibition）的存在机制及生理意义尚不明确的问题，系统探讨了野生型及DMDmdx（杜氏肌营养不良模型）小鼠PC中由δ亚基GABAA受体介导的紧张性GABA电流的特性。研究发现PC存在显著的δ-GABAA受体介导的紧张性电流，其在DMDmdx小鼠中上调3倍，补偿了相位性抑制的缺失，维持神经元兴奋性平衡。该研究揭示了PC抑制调控新机制，为理解神经发育疾病中小脑功能异常提供了新视角。

　　

在我们复杂的大脑中，小脑如同一个精密的指挥家，协调着身体的运动和平衡。而小脑皮层中最重要的“决策者”是浦肯野细胞（Purkinje cells, PCs），它们接收来自外界的各种信号，并发出最终的指令。为了确保指令的准确性，浦肯野细胞的活动必须受到精确的调控，其中抑制性信号发挥着关键作用。长期以来，科学家们主要关注一种快速、瞬时的抑制方式——相位性抑制（phasic inhibition），它如同精准的“刹车”，在特定时刻迅速抑制神经元活动。然而，另一种持续、低水平的抑制形式——紧张性抑制（tonic inhibition），是否存在于浦肯野细胞中，以及它扮演着什么角色，却一直是个谜。紧张性抑制就像背景噪音的“调音师”，通过持续激活细胞膜上的突触外GABA_A受体，微妙地调节着神经元的兴奋性。在脑内其他区域（如小脑颗粒细胞）中，这种抑制已被证明对信息处理的保真度和增益控制至关重要。

与此同时，杜氏肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy, DMD）作为一种严重的遗传性疾病，不仅导致肌肉萎缩无力，还常常伴随认知障碍和神经发育异常。DMD^mdx小鼠是研究该疾病的重要模型。先前研究发现，这些小鼠小脑浦肯野细胞的抑制性突触数量减少约一半，快速“刹车”功能严重受损。但令人困惑的是，浦肯野细胞的自发放电频率却基本正常。这暗示着可能存在某种代偿机制，弥补了快速抑制的缺失。一种可能的假设是，持续性的紧张性抑制被上调，以维持神经元活动的总体平衡。

为了解开这些谜团，由Shaarang Mitra、Shailesh N. Khatri和Jason R. Pugh组成的研究团队在《Scientific Reports》上发表了他们的最新研究。他们深入探究了野生型和DMD^mdx小鼠小脑浦肯野细胞中紧张性GABA电流的特性、分子机制及其生理病理意义。

研究人员综合运用了离体脑片全细胞膜片钳 electrophysiology、单细胞定量逆转录聚合酶链反应（single-cell qRT-PCR）、GABA光解非笼锁（GABA uncaging）以及免疫组织化学等多种技术。研究使用了C57BL/6J野生型小鼠、δ-GABA_A受体基因敲除（Gabrd-KO）小鼠以及DMD^mdx小鼠及其同窝野生型对照。实验主要在小脑矢状切片上进行，记录了浦肯野细胞在药物干预下的电流变化，并分析了其mRNA表达。

研究结果

1. 小脑浦肯野细胞存在由GABA_A受体介导的紧张性电流

研究人员通过应用GABA_A受体拮抗剂（如荷包牡丹碱bicuculline或加巴喷丁gabazine/SR95531），在阻断自发性抑制性突触后电流（sIPSCs）的同时，观察到浦肯野细胞的保持电流（holding current）显著降低，这明确表明存在一种持续的紧张性GABA电流。这种电流在幼年（~25 pA）和成年（~9-17 pA）小鼠中均存在，且其幅度与sIPSC的频率无关，排除了高频相位性事件叠加导致假象的可能性。此外，即使使用河豚毒素（TTX）阻断动作电位，紧张性电流依然存在，说明其激活不依赖于动作电位触发的GABA释放，可能源于突触前终末的自发释放或胶质细胞等活动。

2. 浦肯野细胞的紧张性电流依赖于δ亚基GABA_A受体

为了确定介导此电流的受体亚型，研究人员使用了δ亚基特异性激动剂THIP（低浓度下）和阳性变构调节剂DS2。两者均能显著增加浦肯野细胞的保持电流，而后续应用荷包牡丹碱则能将电流抑制到基线以下，证明THIP/DS2诱导的电流确实由GABA_A受体介导。最关键的是，在δ亚基敲除（δ-KO）小鼠的浦肯野细胞中，荷包牡丹碱和THIP引起的电流变化微乎其微。单细胞qRT-PCR结果进一步证实，浦肯野细胞表达δ亚基mRNA，其水平与小脑颗粒细胞相当。这些证据强有力地表明δ-GABA_A受体是浦肯野细胞紧张性电流的主要介导者。

A受体对浦肯野细胞紧张性GABA电流的贡献'>

3. δ-GABA_A受体调控浦肯野细胞的兴奋性

尽管紧张性电流幅度相对较小（~20 pA），但其持续特性可能对神经元放电产生显著影响。通过特异性增强δ-GABA_A受体活性（应用THIP），研究人员发现，电流注射诱发的浦肯野细胞动作电位数量显著减少。这表明，调控紧张性GABA电流的强度足以改变浦肯野细胞的输出，从而影响小脑的信号处理。

4. DMD^mdx小鼠浦肯野细胞的紧张性GABA电流显著增强

与野生型对照相比，DMD^mdx小鼠浦肯野细胞的紧张性GABA电流幅度增加了约三倍。尽管相位性抑制电荷转移减少，但由于紧张性电流的大幅上调，DMD^mdx浦肯野细胞的总抑制性电荷转移反而显著高于野生型。紧张性电流在总抑制中的占比从野生型的约54%飙升至DMD^mdx的约89%。这种上调并非源于细胞形态改变（细胞面积和钙结合蛋白信号无差异），而更可能是功能上的代偿。

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5. DMD^mdx浦肯野细胞中δ-GABA_A受体表达上调

DS2能显著增强DMD^mdx浦肯野细胞的紧张性电流，但对野生型细胞无显著影响，提示DMD^mdx细胞表达了更多功能性δ-GABA_A受体。通过GABA非笼锁技术绘制剂量反应曲线发现，DMD^mdx浦肯野细胞对低浓度GABA的敏感性更高（EC50左移），但最大反应不变。这符合高亲和力δ-GABA_A受体表达增加的特征，而非受体总数增加。

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结论与意义

本研究首次明确证实了小脑浦肯野细胞存在由δ-GABA_A受体介导的紧张性抑制电流，并揭示了其在调控神经元兴奋性中的生理作用。在DMD^mdx疾病模型中，紧张性电流的代偿性上调是应对相位性抑制缺失的关键机制，它维持了浦肯野细胞总体抑制水平和平均放电率的稳定。然而，这种代偿可能无法完全复制快速、瞬时的相位性抑制在精确时间控制（如暂停放电、同步化）方面的功能，这或许解释了DMD^mdx小鼠表现出的小脑相关行为缺陷。

该研究极大地扩展了我们对小脑微电路抑制调控机制的理解，将紧张性抑制的重要性从颗粒细胞延伸到了主要的输出神经元——浦肯野细胞。它揭示了神经回路在病理条件下通过调整抑制性电流的“组成”（相位性 vs. 紧张性）来维持功能稳定的新机制。这不仅为理解Duchenne肌营养不良等疾病中的小脑功能障碍提供了新的视角，也为针对GABA能系统（特别是δ-GABA_A受体）治疗相关神经系统并发症提供了潜在靶点。未来研究利用浦肯野细胞特异性基因操作工具，将进一步阐明紧张性和相位性抑制在运动学习、认知等高级小脑功能中的独特与协同作用。