GDE2通过调控Glypican-6介导的Wnt信号通路维持神经元中TDP-43核定位的新机制

《Scientific Reports》：Regulation of glypican 6-mediated Wnt activation maintains TDP-43 nuclear localization in neurons

本研究聚焦于神经退行性疾病中TDP-43蛋白异常定位的关键机制。研究人员发现，GDE2通过切割GPI锚定蛋白Glypican-6（GPC6）调控其膜表达，从而抑制Wnt/β-catenin信号通路的过度激活。实验证实GPC6过表达会破坏核孔复合体（NPC）完整性、扰乱Ran依赖的核质运输（NCT），导致TDP-43胞质错误定位；而Gpc6基因减量可挽救Gde2KO小鼠的上述病理表型。该研究揭示了GDE2/GPC6/Wnt信号轴在维持神经元稳态中的核心作用，为阿尔茨海默病（AD）、肌萎缩侧索硬化（ALS）等TDP-43蛋白病变的防治提供了新靶点。

　　

在神经退行性疾病的研究领域，TAR DNA结合蛋白43（TDP-43）的异常定位和功能失调一直被视为关键病理标志。这种蛋白质正常情况下驻留在细胞核内，负责调控数千种信使RNA的剪接和稳定性。然而，在阿尔茨海默病（AD）、肌萎缩侧索硬化（ALS）和额颞叶痴呆（FTD）等疾病中，TDP-43却错误地聚集在细胞质中，丧失其正常的核功能，导致神经元退化和死亡。虽然科学家们已经发现核孔复合体（NPC）损伤和核质运输（NCT）障碍与TDP-43的错误定位有关，但这些细胞水平的变化在疾病中是如何起始的，至今仍不清楚。

近年来，一种名为甘油磷酸二酯磷酸二酯酶2（GDE2）的酶引起了研究人员的注意。GDE2能够切割某些蛋白质表面的糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定结构，从而将这些蛋白质从细胞膜上释放。在成熟神经元中，GDE2对于维持NPC完整性、正常NCT以及TDP-43的核定位至关重要。研究表明，GDE2功能的丧失会导致经典的Wnt信号通路过度激活，进而引发一系列下游的病理变化。更值得注意的是，在AD和ALS患者的死后脑组织以及诱导多能干细胞（iPSC）分化的神经元模型中，都观察到了GDE2的异常积累或表达下降，且这些异常与TDP-43病变高度相关。因此，深入解析GDE2如何精确调控Wnt信号通路，对于理解神经退行性疾病的初始机制具有重大意义。

发表在《Scientific Reports》上的这项研究，由约翰斯·霍普金斯大学医学院的Nan Zhang和Shanthini Sockanathan主导，旨在揭示GDE2调控神经元Wnt信号通路的直接下游靶点，并阐明该调控轴在TDP-43稳态维持中的作用。研究人员将目光投向了Glypican（GPC）家族蛋白，特别是GPC6，因为该家族成员是GDE2的已知底物，并且在ALS等疾病的基因组关联分析（GWAS）中显示出相关性。

为开展此项研究，作者综合运用了多种关键技术方法：利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据筛选与Gde2共表达的基因；通过细胞表面生物素化标记和蛋白质印迹法（Western Blot）分析蛋白表达与定位；采用SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞系和SuperTopflash（STF）报告基因细胞系进行体外Wnt信号通路功能验证；构建Gde2基因敲除（KO）与Gpc6基因杂合（Het）小鼠模型进行在体功能研究；使用腺相关病毒（AAV）介导的基因过表达技术在特定脑区操控GPC6水平；并通过免疫组织化学/免疫荧光染色、RNAscope原位杂交等技术对小鼠脑组织切片进行高分辨率成像和定量分析。所有动物实验均遵循约翰斯·霍普金斯大学动物护理和使用委员会的规定。

Gde2和Gpc6在皮质神经元中的表达与调控

研究人员首先通过分析成年小鼠大脑皮质的单细胞RNA测序数据发现，在表达Gde2的兴奋性神经元中，Gpc6的mRNA表达水平最高，且两者在皮质第五层和第六层的椎体束（PT）神经元和端脑内（IT）神经元中显著共表达。RNAscope实验进一步证实了Gpc6在皮质各层神经元中的广泛分布。为了验证GDE2是否调控GPC6，他们对野生型（WT）和Gde2KO小鼠的原代皮质神经元进行细胞表面生物素化分析。结果显示，在Gde2KO神经元中，细胞膜表面的GPC6蛋白以及总GPC6蛋白水平均显著升高，而Gpc6的转录本水平未见变化，表明GDE2在转录后水平调控GPC6的膜表达。这些发现支持了GDE2通过切割GPC6的GPI锚来限制其细胞表面表达，从而抑制Wnt信号过度激活的模型。

GPC6增强Wnt7b介导的信号传导

接下来，研究团队探究了GPC6如何影响Wnt信号。他们发现Wnt7b与Gde2和Gpc6在皮质神经元中共同表达。在SH-SY5Y细胞中，当低剂量Wnt7b不足以激活β-连环蛋白（β-catenin）时，共表达GPC6能显著提高非磷酸化β-连环蛋白（non-p-β-catenin）的水平，表明GPC6能够增强Wnt7b的信号传导。相反，利用小干扰RNA（siRNA）敲低内源性GPC6，则能消除Wnt7b引起的高水平non-p-β-catenin表达，证明GPC6是Wnt7b信号传导所必需的。进一步的报告基因实验（Topflash assay）表明，GPC6能够特异性地增强Wnt7b/Lrp6通过Fzd1、Fzd4和Fzd7受体介导的经典Wnt信号激活，而对Fzd8则无此作用，提示了GPC6作用机制的特异性。

GPC6过表达在皮质中重现Gde2KO表型

为了验证GPC6在体水平的功能，研究人员向携带Wnt报告基因（WNT-GFP-MYC）的成年小鼠注射表达HA-GPC6的腺相关病毒（AAV）。结果显示，与表达对照病毒（HA-GFP）的神经元相比，表达HA-GPC6的皮质神经元其核内MYC报告蛋白信号显著增强，表明Wnt信号通路被激活。更重要的是，这些神经元出现了与Gde2KO小鼠完全一致的病理特征：核孔蛋白Nup98在胞质中异常累积、调控核质运输的Ran蛋白的核质（N/C）比值下降、以及TDP-43的核内强度降低和N/C比值下降。这表明，仅仅增加GPC6的表达就足以破坏NPC、干扰NCT，并导致TDP-43的核功能障碍。

Gpc6基因减量挽救Gde2KO动物的TDP-43错误定位

最后，也是最关键的证据来自于遗传拯救实验。由于Gpc6完全敲除会导致小鼠新生儿期死亡，研究者构建了Gde2KO; Gpc6+/-（Gde2KO; Gpc6Het）双基因突变小鼠。在4月龄的Gde2KO; WNT-GFP-MYC小鼠皮质中，存在大量核MYC阳性的神经元，提示Wnt信号持续激活；而在Gde2KO; Gpc6Het; WNT-GFP-MYC小鼠中，核MYC阳性神经元的比例恢复到了野生型水平。同时，在Gde2KO; Gpc6Het小鼠中，Gde2KO所导致的Ran蛋白N/C比值降低和TDP-43蛋白N/C比值降低（即胞质错误定位）均被成功挽救，恢复至与野生型小鼠无显著差异的水平。这强有力地证明，降低GPC6的表达水平可以逆转因GDE2缺失而引起的Wnt信号过度激活、NCT障碍和TDP-43定位异常。

研究结论与意义

本研究清晰地阐明了一条名为“GDE2-GPC6-Wnt”的生理性信号轴在维持神经元健康中的核心作用。其核心结论是：在成年神经元中，GDE2通过持续切割GPC6的GPI锚，限制其在细胞膜表面的富集，从而防止Wnt信号通路（特别是由Wnt7b/Lrp6/Fzd1,4,7介导的）发生持续、过度的激活。适度的Wnt信号对神经元功能是必需的，但一旦失控，就会侵蚀核孔复合体（NPC），破坏Ran GTP酶梯度依赖的核质运输（NCT），最终导致TDP-43无法正常进入细胞核执行其关键功能，引发神经元变性。

这项研究的重大意义在于：首先，它从分子机制上解释了为何在AD、ALS等疾病的患者脑组织中会同时观察到GDE2异常和TDP-43病变，将两个看似独立的病理事件通过GPC6和Wnt信号通路紧密联系起来，为理解疾病起始机制提供了新视角。其次，研究确定了GPC6是连接GDE2与Wnt信号通路的关键分子节点，这不仅为解释相关GWAS研究中GPC6与神经退行性疾病的风险关联提供了功能证据，也使其成为一个潜在的治疗靶点。未来，针对GPC6-Wnt信号轴进行干预，例如开发小分子药物抑制其过度激活，或许能够为目前缺乏有效治疗手段的TDP-43蛋白病变相关疾病开辟新的治疗策略。