细胞外加工POMC产生短链β-内啡肽(1-9)通过δ阿片受体调控大鼠角质形成细胞的作用与机制

《Scientific Reports》：Extracellular processing of proopiomelanocortin generates short beta endorphin that regulates rat keratinocytes via the delta opioid receptor

本研究针对特应性皮炎(AD)中瘙痒与皮肤屏障功能障碍的病理环节，探讨了前阿片黑素细胞皮质激素(POMC)在皮肤中的非经典加工机制。研究人员发现，在AD炎症皮肤中，POMC经细胞外加工生成截短肽β-END(1-9)，该肽通过激活角质形成细胞表达的δ阿片受体(DOR)，调控meprin1a和SMPD2等基因表达，影响胶原成熟与神经酰胺代谢，为AD的皮肤屏障修复提供了新靶点。

　　

在皮肤健康的复杂调控网络中，前阿片黑素细胞皮质激素（POMC）作为一个关键的前体蛋白，能够被加工成多种具有不同生物活性的肽段，如α-黑素细胞刺激素（α-MSH）和β-内啡肽（β-END），它们参与调节包括色素沉着、免疫应答和瘙痒感知在内的多种生理病理过程。特应性皮炎（AD）是一种常见的慢性炎症性皮肤病，以剧烈瘙痒和皮肤屏障功能受损为主要特征，严重影响患者的生活质量。在AD的发病机制中，神经免疫调节异常扮演着重要角色，而POMC衍生肽的失调被认为是其中的一个关键环节。然而，与在垂体等经典内分泌器官中不同，皮肤中的角质形成细胞和黑色素细胞虽然能够合成POMC，但其细胞内负责切割POMC的激素原转化酶（PC1/3和PC2）的表达水平相对较低。这引出了一个重要的科学问题：POMC在皮肤中是如何被激活并产生具有生物活性的短肽的？尤其是β-END，其在皮肤炎症和瘙痒中的作用机制尚不清晰。传统的观点认为POMC主要在细胞内被加工，但越来越多的证据表明，细胞外的蛋白水解加工可能是一条重要的替代途径。例如，先前的研究发现，在皮肤中，POMC可以被肥大细胞来源的类胰蛋白酶（tryptase）在细胞外切割产生截短的α-MSH(1-8)。那么，类似的机制是否也适用于β-END的生成？如果存在这种细胞外加工机制，所产生的β-END片段又具有怎样的生物学功能？它通过何种受体发挥作用？对这些问题的探索，不仅有助于深化对皮肤生理的理解，也可能为AD等皮肤病的治疗提供新的思路。本研究由Hiroyuki Yamamoto、Yoshikazu Sawaguchi、Ayaka Koida和Toshiyuki Yamada合作完成，发表于《Scientific Reports》杂志，旨在揭示AD皮肤中POMC的细胞外加工命运及其功能产物对皮肤稳态的调控作用。

为开展本研究，研究人员综合运用了多种关键技术。在样本来源上，研究使用了由屋尘螨抗原诱导的NC/Nga小鼠AD模型皮肤组织以及胎儿大鼠皮肤角质形成细胞（FRSK）和永生化人角质形成细胞（HaCaT）系。关键技术方法包括：利用免疫沉淀（IP）结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）对AD小鼠皮肤提取物中的β-END样免疫活性成分进行分子量鉴定；通过反相高效液相色谱（RP-HPLC）和酶联免疫吸附测定（ELISA）对目标肽段进行分离和验证；采用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和蛋白质印迹（Western Blot）检测角质形成细胞中μ、δ、κ三种阿片受体（MOR, DOR, KOR）的mRNA和蛋白表达；使用cAMP-Glo测定法分析β-END(1-9)及其类似物对FRSK细胞内环磷酸腺苷（cAMP）水平的抑制效应，以评估其通过DOR的信号转导活性；通过DNA微阵列芯片和定量RT-PCR（qRT-PCR）进行基因表达谱分析，筛选并验证β-END(1-9)处理FRSK细胞后差异表达的基因。

Structural analysis ofβ-END-like immuno-active components produced in atopic inflammatory skin

研究人员首先从AD模型小鼠的炎症皮肤组织中提取肽段，并使用特异性识别β-END N端（1-9位氨基酸）活性位点的抗体进行免疫沉淀富集。通过MALDI-TOF MS分析，他们在AD皮肤提取物中检测到一个分子量约为1019.687 Da的肽段片段，而在非炎症皮肤中则未检测到该信号。根据类胰蛋白酶（具有胰蛋白酶样特异性，即切割精氨酸和赖氨酸残基的C端）的切割特性，研究人员预测POMC可能被其切割产生β-END(1-9)。该预测肽段的分子量与质谱检测结果高度吻合。为了进一步确认该免疫活性组分的身份，他们进行了RP-HPLC分析。结果显示，从AD皮肤中分离出的免疫活性组分的保留时间与合成的β-END(1-9)标准品完全一致。这些证据共同表明，在AD的炎症皮肤环境中，POMC确实通过细胞外加工机制（很可能涉及类胰蛋白酶）产生了截短形式的β-END(1-9)。

Exploration of opioid receptors expressed in epidermal keratinocytes

接下来，研究团队探究了β-END(1-9)可能作用的靶点——阿片受体在表皮角质形成细胞中的表达情况。通过RT-PCR检测，他们发现在大鼠来源的FRSK细胞中，仅能检测到δ阿片受体（DOR）的mRNA表达，而μ阿片受体（MOR）和κ阿片受体（KOR）的表达则检测不到。DNA测序证实该RT-PCR产物与大鼠DOR序列完全同源。在蛋白水平，Western Blot分析也在FRSK细胞中检测到约50 kDa的DOR蛋白条带，与小鼠脑组织阳性对照的条带大小一致。作为对比，在人永生化角质形成细胞HaCaT中，RT-PCR检测到了MOR、DOR和KOR三种受体的mRNA表达。此外，在AD模型NC/Nga小鼠的皮肤组织中，也检测到MOR和DOR的表达，但炎症区域与非炎症区域的表达水平无显著差异。这些结果表明，DOR是FRSK角质形成细胞中主要表达的阿片受体亚型。

Effects ofβ-END(1-9) via DOR on keratinocytes

为了验证DOR的功能活性，研究人员检测了受体激动后对细胞内第二信使cAMP水平的影响。他们使用福斯高林（forskolin）刺激FRSK细胞以显著提升细胞内cAMP水平（设为100%），然后观察不同浓度的β-END、甲硫氨酸-脑啡肽（Met-ENK，一种已知的DOR偏好性激动剂）和β-END(1-9)对福斯高林诱导的cAMP增加的抑制效果。结果表明，这三种肽均能以剂量依赖的方式抑制cAMP的升高，证实了DOR在FRSK细胞中是功能性的。其中，β-END(1-9)的半最大效应浓度（EC₅₀）约为44 nM，而Met-ENK的效力稍强，EC₅₀约为25 nM，说明β-END(1-9)是DOR的一个完全激动剂，尽管其效力略低于Met-ENK。为了深入探索β-END(1-9)通过DOR对角质形成细胞产生的生物学效应，研究人员对经100 nM β-END(1-9)或Met-ENK处理24小时的FRSK细胞进行了DNA微阵列分析，筛选差异表达基因。结果显示，两种处理均能显著上调Meprin1a基因的表达，并下调SMPD2基因的表达。这一发现随后通过qRT-PCR得到了验证。Meprin1a是一种金属蛋白酶，参与前胶原的切割成熟过程，对维持皮肤胶原结构至关重要；而SMPD2（鞘磷脂磷酸二酯酶2）则参与鞘磷脂代谢，其表达异常可能与皮肤屏障功能障碍有关。这表明β-END(1-9)通过激活DOR，可能调控与皮肤屏障功能和细胞外基质稳态相关的基因表达。

本研究的主要结论和重要意义在于：首次系统地证实了在特应性皮炎（AD）的炎症皮肤环境中，POMC可以通过一种非经典的细胞外加工途径被激活，生成截短型的β-END(1-9)肽段。该肽段并非来源于垂体等组织中的经典细胞内加工和N端乙酰化产物，而是由皮肤局部（很可能由肥大细胞等释放的类胰蛋白酶）对释放到细胞外的POMC前体进行切割所产生。功能研究表明，β-END(1-9)是大鼠角质形成细胞中表达的δ阿片受体（DOR）的一个完全激动剂，能够有效抑制细胞内cAMP信号通路。更为重要的是，该肽段通过DOR信号转导，调控了角质形成细胞中一系列与皮肤稳态相关的基因表达，特别是上调了促进胶原成熟的Meprin1a和下调了可能影响鞘磷脂/神经酰胺代谢的SMPD2。神经酰胺是皮肤角质层细胞间脂质的关键组分，对维持皮肤屏障功能、防止经皮水分丢失至关重要。因此，β-END(1-9)-DOR轴可能通过影响胶原结构和脂质代谢，在AD的皮肤屏障修复和维持中发挥保护性作用。这一发现揭示了POMC在皮肤中具有高度情境依赖性的加工机制和功能多样性。同一种前体蛋白，通过不同的加工方式（细胞内经典途径 vs. 细胞外替代途径），产生不同长度和结构的活性肽（如全长β-END vs. β-END(1-9)），进而偏好性地激活不同的受体（MOR vs. DOR），最终可能介导截然不同的生物学效应（如调节瘙痒 vs. 维持屏障）。这种机制为理解皮肤，特别是在炎症状态下，如何精细调控局部微环境提供了新的视角。尽管本研究存在一些局限性，如使用的是大鼠来源的细胞系，其受体表达谱可能与人类皮肤存在差异，但其所揭示的“POMC-细胞外加工-β-END(1-9)-DOR-皮肤屏障相关基因”这一新型调控轴，为未来开发针对AD皮肤屏障功能障碍的新型治疗策略奠定了重要的理论基础，指出了DOR及其内源性配体β-END(1-9)作为潜在治疗靶点的可能性。