基于高通量追踪技术的果蝇攻击与求偶行为变异研究揭示神经环路特异性调控机制

《Scientific Reports》：High-throughput tracking of freely moving Drosophila reveals variations in aggression and courtship behaviors

本研究针对自由活动果蝇社会行为研究中高分辨率与高通量难以兼顾的技术瓶颈，开发了结合Kestrel多相机阵列显微镜与DeepLabCut姿态估计的创新平台。研究人员通过热遗传学激活特定神经元群体（R26E01-GAL4和R72A10-GAL4），发现pC1神经元特异性增强雌性攻击行为，而R72A10神经元群则促进雄性间求偶行为（UWE）。该研究为神经环路与行为关联研究提供了高精度量化工具，对理解进化保守的社会行为机制具有重要意义。

　　

在动物世界中，攻击和求偶是两种关键的社会行为，它们直接影响着个体获取食物、领地和配偶的成功率。作为模式生物，黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）因其丰富的行为库、清晰的遗传背景和相对简单的神经系统，成为研究社会行为的理想模型。雄性果蝇通过特定的攻击动作（如猛扑lunge）驱逐竞争对手，同时向雌性展示求偶行为（如单侧展翅UWE）；而雌性则主要通过头部撞击（head butt）表达攻击性。这些行为不仅具有高度特异性，其背后的神经机制在物种间也表现出惊人的保守性，为理解更高等动物乃至人类的社会行为提供了重要窗口。

然而，传统行为学研究方法存在明显局限。虽然已有一些自动化跟踪系统，但它们往往无法同时实现高时空分辨率和高通量检测。大多数系统一次只能跟踪单个个体，难以捕捉社会互动的动态过程；帧率过低（如30赫兹）可能错过快速行为事件；而限制果蝇活动空间（如强制二维运动）又会引入行为偏差。这些技术瓶颈严重制约了我们对神经环路精确调控社会行为的理解。

为解决这一难题，研究团队在《Scientific Reports》上发表了最新研究成果。他们开发了一套整合Kestrel多相机阵列显微镜（MCAM）和DeepLabCut姿态估计的创新型平台。Kestrel系统能同时记录8个行为舱内果蝇对的高分辨率视频（576×576像素，60帧/秒），而多视角DeepLabCut模型（顶视、侧视和交叉视角）则实现了果蝇身体部位的高精度跟踪。通过热遗传学技术，研究人员激活了特定神经元群体：已知的R26E01-GAL4标记的pC1神经元和新发现的R72A10-GAL4标记的神经元群。研究不仅验证了pC1神经元激活能增强雌性攻击行为，还首次揭示R72A10神经元激活会特异性促进雄性间求偶行为，而不影响攻击性。

关键技术方法包括：使用Kestrel多相机阵列系统同步记录8个行为舱的果蝇互动视频；采用DeepLabCut训练三个视角（顶视、侧视、交叉视角）的姿态估计模型；通过多视角坐标阵列（MVCA）整合跟踪数据；利用热遗传学（GAL4/UAS-TRPA1系统）在30°C激活特定神经元；对攻击行为（头部撞击、猛扑）和求偶行为（单侧展翅）进行人工标注和自动量化分析；采用免疫组化鉴定R72A10-GAL4标记的神经元分布和神经递质类型。

研究结果首先通过系统验证证实了平台的可靠性。对对照组（TRPA1x w¹¹¹⁸）果蝇的跟踪显示，系统能准确区分雌雄体型差异（雌性体节更大），并检测到雄性果蝇对在局限空间内具有更高的移动速度，与已有报道一致。攻击行为（雌性头部撞击和雄性猛扑）与果蝇对距离呈负相关，进一步证明了量化指标的生物学意义。

在R26E01-GAL4神经元激活实验中，雌性果蝇对在30°C下表现出头部撞击频率显著增加，复现了先前报道的攻击表型。值得注意的是，这种攻击行为增强伴随果蝇对距离的显著缩短，且攻击指数（aggression index）升高，表明激活个体更倾向于“面对面”对峙姿态。而雄性果蝇在相同处理下未表现攻击或求偶行为改变，证明R26E01神经元的作用具有性别特异性。

更具突破性的发现来自R72A10-GAL4神经元激活实验。在雄性果蝇对中，激活这些神经元导致单侧展翅（UWE）频率急剧增加，而攻击行为不受影响。由于UWE是雄性向雌性求偶的典型行为，在野生型雄性间极为罕见，这一结果表明R72A10神经元群能特异性促进求偶动机。进一步分析显示，实验组果蝇对距离更近，追逐指数（pursuit index）显著高于对照组，说明激活个体更频繁地处于“一追一逃”的动态中。

对个体行为事件的精细分析揭示了更深层差异。R26E01>TRPA1雌性的头部撞击多发生在极短距离内（<2.5毫米）且攻击指数高，表现为直接对抗；而R72A10>TRPA1雄性的UWE则可在较远距离发生，暗示其求偶行为受不同空间约束。这些发现提示，不同神经元群可能通过调节社会互动的空间动态来影响行为输出。

通过免疫荧光染色，研究团队初步刻画了R72A10-GAL4标记的神经元特征。该驱动线标记了中央脑区约40-45个神经元，其中在触角叶（AL）和食道下神经节（SOG）交界处存在一个约10-15个神经元的簇。这些神经元投射至高级嗅觉处理区SLP，并与不对称体（AB）存在连接，提示其可能整合嗅觉信息调控行为。值得注意的是，这些神经元并非章鱼胺能（octopaminergic），其神经递质身份仍有待阐明。

研究结论强调，整合高通量成像与多视角姿态估计的新平台能可靠量化果蝇社会行为，并揭示神经环路调控的精细时空特征。pC1和R72A10神经元群分别特异性调控攻击和求偶行为，且这种调控具有性别二态性。所开发的攻击指数和追逐指数等衍生指标，为超越简单行为计数的多维行为分析提供了工具。更重要的是，该研究建立的方法框架将推动未来闭环行为实验的发展，实现实时行为预测与神经干预的结合。

这项工作的意义不仅在于技术平台的创新，更在于它提供了将基因、神经环路和社会行为联系起来的强大工具。通过精确解析行为背后的神经机制，我们离理解社会行为如何进化、如何被调控的终极目标更近了一步。随着此类工具的普及，果蝇模型有望在精神疾病相关社会行为异常的研究中发挥更大价值，为理解人类社交障碍的生物学基础提供新视角。