栀子来源藏花酸通过新型碱水解工艺制备及其抗线粒体缺氧损伤作用与机制研究

《Scientific Reports》：Novel insights into the protective role of crocetin from gardenia jasminoides against mitochondrial hypoxia

本研究针对藏花酸传统制备工艺复杂、成本高的问题，优化了栀子果实直接碱水解提取高纯度藏花酸的工艺（反应时间20 h、温度63℃、KOH浓度11 mol/L，纯度达95.28%），并通过体外化学发光体系证实trans-藏花酸清除·O2-、H2O2和·OH的IC50值显著低于维生素C（P<0.05）。大鼠力竭游泳实验表明，藏花酸可显著缓解低氧（17.3% O2）诱导的腓肠肌线粒体嵴断裂和自噬体累积，为缺氧相关代谢疾病和肿瘤治疗提供了新思路。

　　

在生命科学和医学研究领域，缺氧导致的线粒体损伤是多种疾病的核心病理环节，从高原反应、剧烈运动损伤到缺血性心脑血管疾病，均与细胞能量工厂的功能障碍密切相关。传统中药栀子作为藏花酸的经济来源，其提取工艺一直面临效率低、步骤繁琐的瓶颈。而藏花酸本身的抗氧化活性和对线粒体的保护潜力，虽在慢性疾病模型中有所探索，但在急性缺氧应激下的作用机制尚不明确。

针对这些问题，李伯深团队在《Scientific Reports》发表的研究中，开发了一种创新的“直接碱水解-纯化”工艺，成功从栀子果实中高效制备高纯度trans-藏花酸，并系统评估了其抗氧化能力及对线粒体缺氧损伤的保护作用。该研究不仅优化了生产工艺，还通过多模型验证了藏花酸的生物学活性，为相关药物开发提供了扎实的实验依据。

研究采用Box-Behnken响应面法优化提取工艺，通过单因素实验和三维响应面分析确定最佳参数；利用核磁共振（NMR）氢谱和碳谱对产物结构进行鉴定；通过三种化学发光体系（luminol-DMSO-NaOH、luminol-H₂O₂、luminol-FeSO₄-H₂O₂）定量评估自由基清除能力；并采用Wistar雄性大鼠（北京SPF生物技术有限公司提供）的力竭游泳模型，通过透射电镜观察腓肠肌线粒体超微结构变化。

单因素实验结果分析

通过反应时间、温度、料液比和碱浓度四个因素的筛选实验发现，提取效率在特定条件下出现峰值。例如，反应时间超过12小时后综合评分下降，而碱浓度超过12 mol/L时可能因破坏藏花酸共轭双键结构导致效率降低。这些结果为响应面实验设计提供了参数范围依据。

响应面方法学结果分析

基于Box-Behnken设计建立的模型显著（P<0.05），失拟项不显著（P>0.05），表明模型预测性良好。方差分析显示，碱浓度对藏花酸得率的影响最大（F=26.9），其次为反应时间（F=22.02）和温度（F=5.84）。响应面曲线表明，反应时间与碱浓度的交互作用对提取效率有显著影响（P<0.05）。最终优化工艺条件为：反应时间20 h、温度63℃、KOH浓度11 mol/L，此时藏花酸实际平均含量为13.5078±4.5859 mg/g，实际平均得率为1.9619±0.1368 mg/g，与预测值无显著差异（P>0.05）。

藏花酸纯化与结构表征

通过两次碱提酸沉纯化，藏花酸纯度从62.25%提升至95.28%。核磁共振氢谱显示特征峰：12.16 ppm（2H, COOH）、7.15 ppm（2H, H-3/H-3'）、1.86 ppm（6H, 2-CH₃/2'-CH₃）；碳谱谱图与SciFinder数据库（CAS: 27876-94-4）一致，确认产物为trans-藏花酸。

体外抗氧化活性

在三种化学发光体系中，trans-藏花酸对超氧阴离子（·O₂^-）、过氧化氢（H₂O₂）和羟基自由基（·OH）的半数抑制浓度（IC₅₀）均显著低于维生素C。其中对·O₂^-的清除能力尤为突出（IC₅₀=2.65 μg/mL），约为维生素克的55倍（P<0.001），表明其具有极强的自由基清除效率。

抗线粒体缺氧损伤研究

透射电镜结果显示，低氧模型组（MG）大鼠腓肠肌线粒体嵴断裂、自噬体增多，肌纤维间空隙扩大。而藏花酸治疗组（CG）线粒体排列更紧密，嵴断裂减少，组织水肿改善，表明显著缓解了缺氧运动引起的线粒体超微结构损伤。

本研究通过工艺创新实现了藏花酸的高效绿色制备，并首次在急性缺氧运动模型中证实其线粒体保护作用。藏花酸强大的抗氧化活性可能通过减少活性氧（ROS）积累、维持线粒体膜电位和嵴结构完整性发挥作用。这一发现为藏花酸在缺血性心脏病、脑卒中及缺氧相关肿瘤等领域的应用提供了新的理论依据。尽管动物实验样本量较小（n=2/组）可能影响统计效力，但组内一致的形态学变化仍支持结论的可靠性。未来研究可扩大样本量，并深入探索其作用机制与临床应用潜力。