圆红冬孢酵母染色体水平基因组组装揭示人工培养条件下的异常染色体进化

《Scientific Reports》：Chromosome-resolved genome assemblies of Rhodotorula toruloides reveal abnormal chromosomal evolution under artificial culture conditions

本研究针对圆红冬孢酵母(Rhodotorula toruloides)种内遗传多样性高、分类边界模糊的问题，通过长读长测序技术完成了7株R. toruloides及相关物种的染色体水平基因组组装。比较基因组学分析发现，虽然Rhodotorula属通常保持17条染色体的保守宏观同线性，但部分实验室菌株在人工培养条件下出现了异常染色体易位。特别值得注意的是，菌株JCM 10021在与同源菌株NBRC 10513分离后积累了大量染色体重排，表明人工培养环境可能诱导结构性突变。研究还发现，单倍体菌株NP11的基因组完全来源于单一亲本IFO 0559，而非原先认为的双亲本杂交后代。这些发现警示实验室菌株可能在染色体水平发生难以察觉的变异，强调了低温保存等规范菌株保藏的重要性。

　　

在微生物研究和工业应用中，圆红冬孢酵母(Rhodotorula toruloides)因其卓越的产油能力和类胡萝卜素积累特性而备受关注。这种属于担子菌门(Basidiomycota)、孢子菌纲(Sporidiobolales)的红色酵母，被认为是生物技术领域极具潜力的细胞工厂。然而，这一物种背后隐藏着一个令人困惑的遗传学谜题：被归类为同一物种的不同菌株之间，存在着异常高的遗传多样性。早期的DNA-DNA杂交研究就曾发现，某些R. toruloides菌株与模式菌株的重组率低于20%，而内部转录间隔区(ITS)序列相似性也仅为94.8-97.8%，远低于一般酵母菌种内通常超过99%的相似度。更令人惊讶的是，全基因组平均核苷酸一致性(ANI)分析显示，R. toruloides不同菌株间的ANI值波动在约90%左右，有些甚至低于85%，这一差异水平通常足以区分不同物种。这种巨大的遗传差异使得R. toruloides的物种边界变得模糊不清，也给基于这些菌株的科学研究和技术开发带来了不确定性。

为了深入探索R. toruloides的基因组多样性及其进化机制，由东京农业大学酵母系统学研究室的Yuuki Kobayashi和Masako Takashima领导的研究团队，对多个R. toruloides菌株及相关物种进行了全面的基因组学研究。他们采用第三代长读长测序技术，完成了7株R. toruloides、1株R. sphaerocarpa(与R. toruloides亲缘关系密切的另一Rhodotorula物种)、2株可相互交配的R. kratochvilovae以及1株Rhodosporidiobolus nylandii(姐妹属的模式种)的基因组测序和组装。

研究人员通过先进的长读长测序技术(PacBio Sequel II和Oxford Nanopore)获得了高质量的基因组数据，并利用Hifiasm和NECAT等组装工具构建了染色体水平的基因组草图。k-mer分析确认所有被测菌株均为单倍体基因组。引人注目的是，所有菌株的基因组都被组装成17条染色体，大小约为20 Mbp，其中三个菌株(R. toruloides NBRC 10513和两株R. kratochvilovae)的组装结果在每条contig两端都检测到端粒重复序列，强烈表明这些组装达到了真正的染色体水平。BUSCO评估显示基因组完整性达85-90%，基因预测完整性达95-98%，证明组装质量极高。

比较基因组学分析揭示了令人惊讶的发现。虽然Rhodotorula属的物种普遍保持着保守的染色体宏观同线性，但某些R. toruloides菌株却出现了明显的染色体结构变异。特别是，菌株JCM 10020(对应IFO 0559)和JCM 10021(对应IFO 0880)展示了多起染色体易位事件。更有趣的是，系统发育分析表明，JCM 10021与NBRC 10513源自同一原始分离株(IFO 0880)，但JCM 10021积累了更多独特的染色体重排，这些变异很可能是在实验室培养过程中逐渐产生的。

研究人员通过比对公共数据库中的基因组数据(CBS 14对应JCM 10020，NBRC 0880对应JCM 10021)，并使用PCR实验验证了特定易位位点，排除了组装错误的可能性，确认这些染色体重排是真实存在的结构性变异。

关于染色体结构保守性的研究发现，大多数Rhodotorula菌株，包括R. toruloides JCM 10049、JCM 10295、JCM 10296、R. sphaerocarpa JCM 8202、R. kratochvilovae JCM 10449和JCM 10450以及Rhodosporidiobolus nylandii JCM 10213，都保持着几乎完全一致的染色体组织结构，这表明Rhodotorula属具有高度保守的基本染色体架构。相比之下，菌株JCM 10020、NBRC 10512、JCM 10021和NBRC 10513则出现了多个染色体易位。研究人员将对应JCM10296和JCM10049且无任何易位的染色体结构定义为"典型宏观同线性"。

关于菌株进化关系的研究得出了重要结论。系统发育分析和ANI比较将R. toruloides菌株分为几个遗传簇：一个簇包含JCM 10020、NBRC 10512、NBRC 0559、CECT 1137和NP11；另一个簇包含JCM 10021、NBRC 0880、NBRC 10513、ATCC 204091、NBRC BOT-A2和NBRC 1236；第三个簇包含NBRC 10032和JCM 10295。每个簇内部的ANI值超过99.97%，表明它们很可能源自共同的祖先。而不同簇之间的遗传距离则大得多，例如NBRC 10032和JCM 10295与其他菌株的ANI仅为84%左右。

特别值得关注的是对NP11菌株起源的重新评估。NP11一直被报道为来自二倍体菌株CGMCC 2.1389(对应IFO 8766)的单倍体后代，而IFO 8766是由IFO 0559和IFO 0880杂交产生的。然而，本研究的比较分析显示，NP11的基因组与IFO 0559(即JCM 10020和NBRC 0559)高度相似，而与IFO 0880(即JCM 10021和NBRC 0880)几乎无相似之处。通过将NP11的测序reads映射到JCM 10020和JCM 10021的组合组装上，研究人员发现NP11 reads在JCM 10020上的映射深度集中在30x左右，而在JCM 10021上则普遍低于25x(重复区域除外)。这一结果表明，尽管NP11是通过有性杂交产生的，但其基因组完全来自IFO 0559亲本，未检测到IFO 0880的贡献。

本研究的关键技术方法包括：从日本微生物保藏中心(JCM)、RIKEN生物资源中心(BRC)和日本国家生物资源中心(NBRC)获取菌株样本；使用PacBio Sequel II和Oxford Nanopore GridION X5平台进行长读长测序；采用Hifiasm和NECAT进行基因组组装；通过Funannotate进行基因预测和注释；利用BUSCO评估组装和注释完整性；应用BLAST、OrthoFinder、fastANI等工具进行比较基因组学和系统发育分析。

研究结果部分通过多个方面展示了重要发现：

长读长测序为基础的Rhodotorula toruloides及相关菌株基因组组装表明，所有被测菌株的基因组大小约为20 Mbp，分布在17条染色体上。最小的基因组是R. sphaerocarpa JCM 8202，最大的是Rhodosporidiobolus nylandii JCM 10213。BUSCO评估检测到85-90%的基因为完整基因，重复基因少于1%。三个菌株的组装在所有contig两端都含有端粒重复序列，表明达到了染色体分辨率水平。

染色体宏观同线性分析发现，R. toruloides的基因组比较揭示了与其整体序列相似性不一致的重排现象。例如，R. toruloides JCM 10020与JCM 10049相比有几个染色体易位，尽管它们的ANI高达99.0%。JCM 10021显示出更广泛的易位，ANI为89.1%。相比之下，JCM 10296和JCM 10295虽然与JCM 10049的ANI分别为89.1%和84.1%，但显示出相同的染色体宏观同线性。甚至在与R. kratochvilovae JCM 10449和Rhodosporidiobolus nylandii JCM 10213的种间比较中，也观察到很少或没有染色体间重排。

系统发育关系研究将R. toruloides菌株分为几个遗传簇，簇内ANI值超过99.97%，而簇间遗传距离较大。特别值得注意的是，NP11菌株的基因组与IFO 0559(即JCM 10020)高度相似，而与IFO 0880(即JCM 10021)几乎无相似性，表明尽管NP11来自有性杂交，但其基因组完全继承自IFO 0559亲本。

研究的讨论和结论部分强调了这一发现的重要意义。在模式酵母如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)中，染色体重排会破坏正常的减数分裂，导致生殖障碍。由于Rhodotorula物种在自然条件下可能进行有性繁殖，因此与有性生殖相关的选择压力可能有助于大多数菌株中染色体同线性的广泛保守。相反，在实验室条件下，菌株无需交配即可保存，并通过重复培养进行无性繁殖。因此，异常染色体可能不会通过有性生殖过程中的负选择被消除，松弛的选择压力可能使染色体突变积累。这一假设可以解释为什么在某些实验室菌株中经常观察到不寻常的染色体重排。

值得注意的是，在测序菌株中观察到的染色体重排不涉及核苷酸序列的大规模变化；它们的基因序列几乎相同。因此，仅基于基因序列或表型特征很难检测到这种染色体变化。事实上，经历了染色体易位的JCM 10020和JCM 10021菌株没有表现出显著的生长缺陷，尽管精确的功能影响尚不清楚。

本研究结果提示，人工培养可能导致不规则的染色体突变，强调了在实验室和生物资源中心需要谨慎处理微生物菌株以避免遗传改变。它们强烈强调了以生物学无活性状态(如冷冻保存或冻干)保存菌株的重要性。该研究还警示，目前被认为是等同的、但在不同机构保存的菌株，实际上可能在染色体水平上发生分化而不被察觉。相反，ANI比较和基于基因组的系统发育分析显示，一些不被认为是相同的菌株实际上共享几乎相同的基因组序列，表明它们源自同一来源。

与先前报道R. toruloides遗传分化的研究一致，某些R. toruloides菌株——特别是JCM 10295和NBRC 10032，它们与其他菌株的ANI低于85%——表现出显著的基因组分化。因此，R. toruloides似乎包含了相当于多物种的遗传多样性。为了准确划分R. toruloides内的物种边界，需要基于生物物种概念进行杂交实验。尽管已有报道称遗传距离较远的R. toruloides菌株间杂交可形成菌丝体和冬孢子，但确认单倍体后代产生的报告非常少。证明可育后代的形成对于确认严格的物种边界至关重要。然而，本研究结果也提出了另一种可能性：某些菌株可能因染色体突变而不规则地丧失了正常有性生殖的能力，尽管它们在遗传上足够接近，有可能杂交。确定R. toruloides的真正多样性范围需要结合遗传和实验方法的进一步研究。

这项发表在《Scientific Reports》上的研究，不仅揭示了圆红冬孢酵母在人工培养条件下的异常染色体进化现象，也为微生物菌种保藏、实验室菌株质量管理以及工业微生物的遗传稳定性评估提供了重要参考。随着合成生物学和代谢工程领域的快速发展，对工业微生物基因组的精确理解和控制变得愈发重要，这项研究为相关领域的研究者敲响了警钟，并提供了宝贵的基因组资源和方法学借鉴。