新型稠合吡唑并吡啶并嘧啶衍生物的合成、分子对接与生物活性评价：具有潜力的抗菌抗氧化双功能候选药物

《Scientific Reports》：Synthesis, molecular docking, ADMET studies and biological evaluation of fused pyrazolopyridopyrimidine derivatives as antioxidant and antimicrobial agents

本研究针对日益严重的微生物耐药性和氧化应激相关疾病问题，设计合成了一系列新型稠合吡唑并吡啶并嘧啶衍生物。研究人员通过系统的体外活性筛选、分子对接模拟和ADMET（吸收、分布、代谢、排泄和毒性）预测，发现多个化合物（如化合物7、9、11、15）展现出显著的广谱抗菌活性（尤其针对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌）和抗氧化活性（如化合物15的DPPH清除率达44.44%）。该研究为开发兼具抗菌和抗氧化活性的新型先导化合物提供了有价值的结构模板和理论依据，具有重要的药物研发前景。

　　

在当今全球公共卫生领域，抗生素耐药性（Antimicrobial Resistance, AMR）的蔓延和氧化应激相关疾病的增多构成了双重挑战。传统的抗菌药物效力正在减弱，而许多慢性疾病和感染过程又与体内过量的活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）积累密切相关。因此，开发兼具抗菌和抗氧化活性的新型分子实体，成为药物化学研究的一个引人入胜的方向。杂环化合物，尤其是含氮杂环，因其结构多样性和广泛的生物活性，一直是药物发现的宝贵来源。其中，吡唑并吡啶（Pyrazolopyridine）骨架因其在多种上市药物（如Tracazolate, Etazolate）中的核心地位而备受关注。在此基础上，进一步稠合嘧啶环形成的吡唑并吡啶并嘧啶（Pyrazolopyridopyrimidine）体系，由于其独特的电子效应和空间结构，有望与多种生物靶点发生高效相互作用，从而可能产生更优的生物学性能。在此背景下，由Hemat Khalaf、Ahmed El-Sayed、Ashraf Sediek和Mohamed Radwan组成的研究团队在《Scientific Reports》上发表了他们的最新研究成果，系统地报道了一系列新型稠合吡唑并吡啶并嘧啶衍生物的设计、合成、生物活性评价及计算机模拟研究。

本研究主要运用了多步有机合成化学方法构建目标化合物库，并通过核磁共振（NMR）、质谱（MS）和红外光谱（IR）等技术确证了其化学结构。生物活性评价采用了针对标准菌株（如大肠杆菌Escherichia coli ATCC 25915、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus ATCC 25923等）的琼脂扩散法和肉汤稀释法测定抗菌活性和最低抑菌浓度（MIC），并使用DPPH（2,2-二苯基-1-苦基肼）自由基清除实验评估抗氧化活性。作用机制探索则通过分子对接（Molecular Docking）模拟化合物与关键靶点（如金黄色葡萄球菌的二氢蝶酸合酶Dihydropteroate synthase、铜绿假单胞菌的LasR蛋白、大肠杆菌的DNA旋转酶DNA gyrase等）的结合模式。此外，还利用计算机模拟（in silico）方法对优选化合物的类药性（Drug-likeness）和ADMET（吸收、分布、代谢、排泄和毒性）性质进行了预测。

化学合成

研究人员以已知的吡唑并吡啶衍生物3为起始原料，通过图3至图7所示的多种反应路径，高效地合成了一系列目标稠合吡唑并吡啶并嘧啶衍生物（4-16）。合成策略灵活运用了缩合、环化、亲核取代等反应，例如，化合物3与原甲酸三乙酯反应得到乙基甲亚胺酸酯4，后者再与水合肼或苯肼等反应，构建出关键的嘧啶环或三唑并嘧啶环系（如化合物5, 7, 8）。与不同胺类化合物的反应则得到了N-取代的衍生物9-12。此外，化合物3与甲酸、甲酰胺、氰基乙酸乙酯和硫脲的反应分别得到了结构各异的衍生物13-16。所有新化合物的结构均通过元素分析和波谱技术（IR, ¹H NMR, ¹³C NMR, MS）得到了充分表征。

抗氧化活性

通过DPPH自由基清除实验评估了所有合成化合物的抗氧化潜力，并以丁基羟基甲苯（BHT）作为阳性对照。结果表明，化合物的抗氧化活性存在明显的构效关系。化合物15表现出最强的自由基清除能力，在2.0 mg/mL浓度下清除率达到44.44±0.80%，其半抑制浓度（IC₅₀）为2.25 mg/mL。化合物13、14和16也显示出较强的活性，其IC₅₀值分别为2.81、2.73和2.68 mg/mL。相比之下，化合物1、2和3的活性较弱。研究指出，化合物15的优异活性可能与其分子中含有的嘧啶乙腈（Pyrimidoacetonitrile）片段有关，该片段能有效贡献氢原子或电子以稳定自由基。

抗菌活性

抗菌筛选结果显示，多个化合物对测试的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有抑制作用。其中，化合物7、9、11、12和15表现出广谱且较强的抗菌活性。特别是化合物11和12对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径分别达到14.60±0.00 mm和13.20±0.00 mm，化合物7对变异链球菌（Streptococcus mutans）的抑菌圈直径达到16.5±0.43 mm。最低抑菌浓度（MIC）测定进一步证实了这些化合物的效力，例如化合物15对金黄色葡萄球菌和粪肠球菌（Enterococcus faecalis）的MIC值均为250 μg/mL，对铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和大肠杆菌的MIC值为500 μg/mL。这些MIC值处于有前景的抗菌活性范围内，尤其对于局部给药应用的开发具有意义。

分子对接研究

为了阐明化合物可能的作用机制，研究团队对活性显著的化合物进行了针对几种关键细菌靶点的分子对接研究。

1. 1.
   与金黄色葡萄球菌二氢蝶酸合酶（DHP S, PDB: 1AD4）的对接：化合物7、9、11和15的结合能（-7.70 至 -8.50 kcal/mol）均优于对照药环丙沙星（Ciprofloxacin, -6.10 kcal/mol）。它们能与活性口袋中的关键氨基酸（如Asp84、Arg52、Val49）形成氢键，并发生多种疏水相互作用，表明其可能通过抑制叶酸合成途径发挥抗菌作用。
2. 2.
   与铜绿假单胞菌LasR蛋白（PDB: 2UV0）的对接：化合物7、9、11和12与LasR蛋白（群体感应系统关键调控因子）显示出强烈的亲和力（结合能-9.50 至 -10.20 kcal/mol），优于环丙沙星（-8.50 kcal/mol）。它们与Thr75、Glu48、Ser129等残基有重要相互作用，提示其可能干扰细菌的毒力因子表达。
3. 3.
   与大肠杆菌DNA旋转酶（DNA gyrase, PDB: 7P2M）的对接：化合物7、9、11和15与该酶的结合能（-7.7 至 -8.90 kcal/mol）也优于环丙沙星（-6.6 kcal/mol），主要与Asp73、Gly77、Thr165等残基相互作用，表明可能抑制细菌DNA复制。
4. 4.
   与肺炎克雷伯菌KPC-2碳青霉烯酶（KPC-2 carbapenemase, PDB: 2OV5）的对接：对接结果显示化合物7、9、11和15也能与该酶结合，结合能（-5.7 至 -5.9 kcal/mol）优于庆大霉素（Gentamicin, -5.3 kcal/mol），提示其可能对产碳青霉烯酶菌株有一定潜力。

计算机ADMET预测

利用瑞士ADME（SwissADME）等在线工具对优选化合物（7, 9, 11, 12, 15）的类药性和药代动力学性质进行了预测。结果表明，这些化合物均符合利宾斯基五规则（Lipinski's Rule of Five），预示其具有较好的口服生物利用度潜力。它们均具有较高的胃肠道吸收预测值，且均不能透过血脑屏障，这有利于降低中枢神经副作用的风险。部分化合物（如9和11）被预测为P-糖蛋白（P-gp）底物，并可能抑制某些细胞色素P450（CYP450）酶（如CYP2C9, CYP3A4），这为后续的结构优化以避免潜在的药物-药物相互作用提供了方向。毒性风险预测显示，大多数化合物在致突变性、致肿瘤性方面未见明显风险，但部分化合物提示有刺激性。总体而言，化合物7的预测性质较为理想。

构效关系（SAR）分析

通过对活性数据的系统分析，研究人员总结了初步的构效关系：

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  抗菌活性：N-苯基取代（如化合物7, 9, 11, 12）对广谱抗菌活性至关重要。苯环上引入吸电子基团（如对位氯、对位溴，见于化合物11和12）能显著增强对金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌的活性。用吡啶环替代苯环（化合物9）会改变抗菌谱。独特的嘧啶乙腈片段（化合物15）也赋予其良好的广谱抗菌活性。
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  抗氧化活性：抗氧化活性与抗菌活性的最优结构要求不同。含有嘧啶乙腈片段的化合物15表现出最强的DPPH清除活性。随着合成路径的推进，化合物结构的变化（从13到16）显示出抗氧化活性的逐步增强，表明特定的杂环系统对自由基清除能力有重要影响。

本研究成功设计并合成了一系列新型稠合吡唑并吡啶并嘧啶衍生物，并对其进行了全面的生物学评价和计算机模拟研究。结果表明，多个化合物（特别是7, 9, 11, 12, 15）兼具显著的抗菌和抗氧化活性。分子对接研究揭示了这些化合物可能通过抑制细菌的关键酶（如DHP S、DNA旋转酶）或干扰毒力调控系统（如LasR）来发挥抗菌作用。计算机ADMET预测显示这些先导化合物具有良好的类药性和药代动力学前景。该研究不仅发现了一批有潜力的双功能候选药物分子，还通过构效关系分析为后续的结构优化指明了方向。这些发现为应对抗生素耐药性和氧化应激相关疾病的治疗策略提供了新的思路和化合物基础，值得进行更深入的临床前研究，包括体内药效学、毒理学以及进一步的机制验证。