乳酸菌与酵母共发酵羊乳中生物活性肽的抗氧化、抗糖尿病及抗炎特性分子互作研究

《Scientific Reports》：Exploring the molecular interaction of bioactive peptides with antioxidative, antidiabetic and anti-inflammatory attributes from sheep milk fermented with lactobacillus and yeast

本研究针对羊乳作为生物活性肽优质来源的潜力尚未被充分开发的问题，研究人员通过乳酸菌(Limosilactobacillus fermentum KGL4)与酵母(Saccharomyces cerevisiae WBS2A)共发酵印度Panchali品种羊乳，系统探究了其产生的生物活性肽的多功能特性。研究结果表明，发酵48小时后获得的肽段展现出显著的抗氧化活性(ABTS法达40.08%)、α-淀粉酶抑制率(72.48%)和α-葡萄糖苷酶抑制率(75.96%)，并在LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞模型中表现出良好的抗炎效果。分子对接分析揭示了关键肽段MSFVSLLLVGILFHATQAEQLTK与人类α-淀粉酶(PDB ID: 1KB3)和α-葡萄糖苷酶(PDB ID: 8EMR)活性位点的稳定结合。该研究为开发针对糖尿病和炎症相关疾病的功能性食品提供了理论依据和新策略。

　　

随着现代生活方式的改变，糖尿病和炎症相关疾病的全球发病率持续攀升，寻找天然、安全的预防和治疗策略成为科研界的重要课题。羊乳作为一种营养丰富的食品，其蛋白质成分具有产生生物活性肽的巨大潜力，但印度Panchali品种羊乳在这一领域的应用价值尚未被充分探索。传统上，乳酸菌(LAB)发酵被用于增强乳制品的功能性，而结合酵母的共发酵策略可能通过协同效应进一步提升生物活性肽的产量和多样性。

本研究创新性地采用Limosilactobacillus fermentum KGL4 (MTCC 25515)与Saccharomyces cerevisiae WBS2A (MG101828)共发酵Panchali羊乳，系统评估了发酵过程中产生的生物活性肽的抗氧化、抗糖尿病和抗炎特性，并深入探究了其分子作用机制。

研究人员主要采用了以下关键技术方法：通过ABTS法、α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制实验评估生物活性；利用OPA法测定蛋白水解程度；采用SDS-PAGE和2D电泳进行蛋白质分离与鉴定；通过RP-HPLC和LC-MS/MS进行肽段分离与序列鉴定；运用FTIR分析蛋白质二级结构变化；借助CLSM观察蛋白质微观结构；利用AutoDock Vina、HADDOCK和HPEPDOCK进行分子对接分析；并通过RAW264.7细胞模型评估抗炎活性。

3.1. 发酵羊乳的抗氧化活性评估

研究发现，随着发酵时间的延长，羊乳的抗氧化活性显著增强。发酵48小时后，ABTS自由基清除活性达到40.08±0.53%，表明共发酵策略有效提升了羊乳的抗氧化潜力。

3.2. 抗糖尿病活性评估

发酵48小时的样品表现出最强的α-淀粉酶抑制活性(72.48±0.69%)和α-葡萄糖苷酶抑制活性(75.96±0.8%)，证实了发酵羊乳在调节碳水化合物消化方面的潜力。

3.3. 蛋白水解活性评估

在2.5%接种量和48小时发酵条件下，蛋白水解活性达到最高值(6.74±0.14 mg/mL)，表明发酵参数显著影响肽段的释放效率。

3.4. SDS-PAGE分析

电泳结果显示，发酵后蛋白质条带明显减少，表明微生物发酵导致了显著的蛋白质降解，生成了更多低分子量肽段。

3.5. 二维凝胶电泳

鉴定出39个蛋白质斑点，分子量主要集中在15-70 kDa范围内，为后续肽段鉴定奠定了基础。

3.6. 肽段鉴定与结构分析

通过LC-MS/MS技术鉴定了多个具有潜在生物活性的肽段序列，其中MSFVSLLLVGILFHATQAEQLTK被预测具有显著的抗氧化和抗糖尿病活性。

3.7. 超滤组分的RP-HPLC分析

<3 kDa的渗透组分显示出最强的α-葡萄糖苷酶抑制活性(77.69%)，而>3 kDa的保留组分则表现出最高的抗氧化活性(50.73%)。

3.8. 傅里叶变换红外光谱

FTIR分析显示发酵后酰胺I带(1639 cm^-1)强度显著增加，表明β-折叠结构增多，证实了蛋白质构象的变化和肽段的形成。

3.9. 分子对接分析

关键肽段MSFVSLLLVGILFHATQAEQLTK与人类α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶显示出良好的结合亲和力，HADDOCK得分分别为-48.3±2.8和-41.0±2.1，HPEPDOCK得分分别为-237.828和-209.866。

3.10. 抗炎活性

发酵羊乳在0.5 mg/mL浓度下能显著降低LPS诱导的RAW264.7细胞中TNF-α、IL-6和IL-1β等促炎细胞因子的表达，同时减少ROS产生和细胞凋亡，表现出良好的抗炎和抗氧化效果。

3.11. 共聚焦激光扫描显微镜分析

CLSM图像显示发酵后蛋白质结构发生明显变化，形成更碎片化的蛋白质基质，证实了发酵过程中蛋白质的降解和肽段的释放。

本研究通过系统的体外实验证明，乳酸菌与酵母共发酵羊乳能产生具有多重生物活性的肽段，这些肽段通过抑制关键酶活性、调节炎症反应和抗氧化途径，展现出良好的抗糖尿病和抗炎潜力。分子对接结果进一步从结构层面揭示了活性肽与靶标酶的作用机制。该研究不仅为羊乳的高值化利用提供了新思路，也为开发针对代谢性疾病和炎症相关疾病的功能性食品奠定了理论基础。然而，这些发现的临床转化仍需进一步的体内研究来验证其生物利用度、安全性和生理相关性。