基于TMT定量蛋白质组学揭示β-氰基-L-丙氨酸和γ-谷氨酰-β-氰基-L-丙氨酸在SH-SY5Y细胞中诱导神经毒性的分子机制

《Scientific Reports》：TMT-based quantitative proteomic assessment of Vicia sativa induced neurotoxicity by β-cyano-L-alanine and γ-glutamyl-β-cyano-L-alanine in SH-SY5Y cells

本研究针对常见野豌豆（Vicia sativa）中两种主要抗营养化合物β-氰基-L-丙氨酸（BCA）和γ-谷氨酰-β-氰基-L-丙氨酸（GBCA）的神经毒性机制不明确的问题，通过建立SH-SY5Y神经元细胞模型，结合TMT定量蛋白质组学技术，发现BCA主要影响DNA损伤修复和核糖体功能相关蛋白，而GBCA则干扰微管结合和细胞周期调控通路。该研究为开发无毒野豌豆品种提供了重要分子靶点，对保障动物饲料安全具有重要意义。

　　

随着全球人口预计到2050年将达到90亿，农业生产力需要提高60%才能满足人类对高蛋白食物的需求。常见野豌豆（Vicia sativa）作为一种高蛋白（24-32%）、耐旱的豆科作物，因其优异的农艺特性而备受关注。然而，其种子中含有的β-氰基-L-丙氨酸（BCA）和γ-谷氨酰-β-氰基-L-丙氨酸（GBCA）对单胃动物具有神经毒性，限制了其在人类食品和动物饲料中的应用。虽然既往研究报道了动物食用野豌豆后出现震颤、抽搐等神经毒性症状，但这两种毒素的具体分子机制仍不清楚。

为解决这一难题，Samuel Riley等研究人员在《Scientific Reports》上发表了最新研究成果。他们首先建立了基于视黄酸分化的SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞的体外神经毒性检测模型，然后运用TMT（Tandem Mass Tags）标记的定量蛋白质组学技术，系统分析了BCA和GBCA处理对神经元蛋白质表达谱的影响。研究发现，这两种毒素通过完全不同的分子途径引发神经毒性：BCA主要干扰DNA损伤修复、翻译过程和氧化应激相关通路，而GBCA则影响有丝分裂、细胞周期调控和凋亡途径。这一发现为理解野豌豆毒素的神经毒性机制提供了新的分子视角。

研究人员采用的关键技术方法包括：利用视黄酸和脑源性神经营养因子（BDNF）诱导SH-SY5Y细胞分化为神经元样细胞；通过Alamar Blue法和IncuCyte活细胞成像系统评估细胞活力和增殖；应用高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）定量种子提取物中的毒素含量；采用10-plex TMT标记结合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行定量蛋白质组学分析；使用流式细胞术进行细胞周期分析。

BCA和GBCA剂量反应

研究人员首先证实了SH-SY5Y细胞经分化后高表达神经丝蛋白H（Neurofilament H）。剂量反应实验显示，50 mM BCA处理48小时后，细胞存活率降低约50%，而GBCA的毒性阈值在40 mM。有趣的是，在原代小鼠神经元中，GBCA在20 mM即表现出显著毒性，而BCA即使达到60 mM也未引起明显毒性反应，表明不同细胞类型对毒素的敏感性存在差异。

BCA与GBCA的协同效应

通过模拟野豌豆种子中BCA与GBCA的天然比例（1:4），研究人员发现10 mM BCA与40 mM GBCA联合使用时，细胞汇合度在60小时出现显著下降，但低浓度组合未表现协同效应，提示两者毒性作用为相加而非协同。

差异表达蛋白鉴定

TMT蛋白质组学共定量6,827个蛋白质。BCA处理组中99个蛋白质表达发生显著变化（26个上调，73个下调），而GBCA处理组有162个差异表达蛋白（76个上调，86个下调）。聚类分析显示两组差异表达蛋白无重叠，证实了两种毒素作用机制的差异性。

GO和KEGG通路分析

BCA处理显著富集的分子功能包括rRNA结合、DNA解旋酶活性和DNA结合，涉及的生物学过程主要与DNA复制、核糖体组装和氧化应激反应相关。GBCA处理则显著影响微管结合、微管蛋白结合和染色体分离等过程。KEGG分析进一步证实，BCA影响的通路与肌萎缩侧索硬化症（ALS）和阿尔茨海默病等神经退行性疾病相关，而GBCA主要通过调控细胞凋亡通路发挥作用。

细胞周期分析

流式细胞术结果显示，GBCA处理使细胞阻滞在G₀-G₁期（77.63±0.32% vs 对照61.67±1.99%），S期和G₂-M期细胞比例显著降低，这与蛋白质组学发现的微管和细胞周期相关蛋白失调结果一致。BCA处理虽引起S期细胞比例轻微增加，但未达统计学显著性。

野豌豆种子提取物的神经毒性评估

研究人员成功将体外检测方法应用于实际种子样本，发现3 kDa过滤可显著提高Timok和Lov-2品种提取物的细胞存活率，提示种子中可能存在某些大分子毒性物质。通过建立GBCA标准曲线，估算的种子毒素浓度与HPLC-MS实测结果高度一致，验证了该检测方法的可靠性。

研究结论表明，BCA可能通过抑制胱硫醚γ-裂解酶（CSE），引起活性氧积累，导致DNA损伤和复制应激；而GBCA则通过干扰微管动力学和细胞周期进程诱发神经毒性。这些发现不仅阐明了野豌豆毒素的分子作用机制，还为培育低毒野豌豆品种提供了潜在的生物标志物。该研究建立的快速体外检测方法有望加速无毒野豌豆品种的选育进程，为可持续农业发展提供新的蛋白质来源。