功能性STING缺失通过调节免疫反应影响α-突触核蛋白预成型纤维帕金森病小鼠模型的运动表型而非多巴胺能神经元存活

《npj Parkinson's Disease》：Lack of functional STING modulates immunity but does not protect dopaminergic neurons in the alpha-synuclein pre-formed fibrils Parkinson’s disease mouse model

本研究旨在探究STING在α-syn病理诱导的神经退行过程中的作用。研究人员通过向野生型和STINGgt/gt小鼠纹状体注射α-syn PFFs，发现STING缺失虽能调节小胶质细胞免疫反应（如增加CD68表达并改变炎症因子mRNA水平），并导致更早出现运动行为缺陷和轴突丢失，但并未改变α-syn病理积累（pSer129、MJF14）及p62沉积，且长期（6个月）多巴胺能神经元损失程度与WT无异。结果表明STING并非α-syn诱导黑质神经元死亡的必要条件，但在大脑对蛋白质异常聚集的免疫应答中具有功能相关性，可能影响疾病症状进展。该研究发表于《npj Parkinson's Disease》。

　　

在大脑的复杂世界里，蛋白质的正常折叠与清除是维持神经元健康的关键。然而，当一种名为α-突触核蛋白（alpha-synuclein, α-syn）的蛋白质错误折叠并聚集时，便会引发一系列连锁反应，最终导致帕金森病（Parkinson's Disease, PD）的特征性病理变化——黑质（Substantia Nigra, SN）多巴胺能神经元的死亡和路易体（Lewy bodies）的形成。这个过程并非孤立发生，大脑的常驻免疫细胞——小胶质细胞（microglia）被激活，释放炎症因子，构成了慢性神经炎症环境，这被认为是推动疾病进展的重要推手。近年来，一个名为STING（Stimulator of interferon genes，干扰素基因刺激因子）的蛋白引起了科学家的注意。STING是先天免疫系统的关键信号分子，通常负责感知细胞质中异常存在的DNA（如病毒DNA或受损的线粒体DNA），进而启动I型干扰素（Type I Interferons）等炎症反应。同时，STING也被发现与自噬（autophagy）——细胞自我清理的机制——的调控有关。鉴于线粒体功能障碍和自噬受损在帕金森病中的重要作用，一个关键问题浮出水面：STING是否在α-syn触发的神经退行过程中扮演了不可或缺的角色？先前有研究指出，缺乏STING可能对帕金森病模型小鼠具有保护作用，但这结论需要更多证据来验证。为了回答这个问题，由Ida H. Klaestrup、Line S. Reinert、Sara A. Ferreira等研究人员组成团队，在《npj Parkinson's Disease》上发表了他们的最新研究。他们利用成熟的α-突触核蛋白预成型纤维（pre-formed fibrils, PFFs）小鼠模型，深入探究了功能性STING缺失对α-syn病理诱导的免疫反应、运动行为、蛋白质病理及多巴胺能神经元存活的长时期影响。

为开展本研究，研究人员运用了几个关键的技术方法。他们通过立体定位注射技术，将小鼠α-syn单体（MONO）或PFFs精准注入野生型（WT）和STING基因敲除（STING^gt/gt）小鼠的纹状体，并设立PBS注射组作为对照。在注射后1个月和6个月这两个时间点，他们系统评估了小鼠的运动行为（包括挑战性横梁测试和圆筒测试），并采用免疫组织化学方法对脑组织进行分析，包括使用立体细胞计数法量化黑质酪氨酸羟化酶（Tyrosine Hydroxylase, TH）阳性神经元和小胶质细胞标志物Iba1阳性细胞，通过光密度测定法分析纹状体TH阳性纤维密度，并对病理蛋白（如磷酸化Ser129 α-syn、聚集态α-syn抗体MJF14、自噬衔接蛋白p62）以及免疫标志物（MHCII, CD68）进行定量分析。此外，他们还利用Fluidigm BioMark动态阵列芯片技术，检测了前额叶皮层、纹状体和腹侧中脑等多个脑区中一系列免疫相关基因的mRNA表达水平。

缺乏功能性STING导致不同的行为缺陷

研究人员首先通过行为学测试评估STING缺失对运动功能的影响。在注射后1个月，挑战性横梁测试结果显示，注射α-syn单体（MONO）的WT和STING^gt/gt小鼠均表现出运动协调性下降。而注射PFFs的影响在基因型间存在差异：只有STING^gt/gt小鼠表现出穿越横梁时间延长、步频降低等明显缺陷，且其步态比PFF-WT小鼠更慢、步幅更小。到了注射后6个月，MONO注射引起的运动缺陷在两种基因型小鼠中依然存在。更重要的是，PFF注射对STING^gt/gt小鼠的影响更为显著，其穿越时间、错误次数和错误步数比均高于其PBS对照组，且步频低于PFF-WT小鼠。在圆筒测试中，PFF-WT小鼠表现为活动量（后肢站立次数）减少和对侧（左侧）肢体使用减少的趋势，而PFF-STING^gt/gt小鼠则表现出明显的肢体使用不对称性，更多地使用同侧（右侧）肢体。这些结果表明，缺乏STING信号会加剧α-syn PFFs诱导的运动行为异常。

PFF注射导致小胶质细胞增生和CD68表达增加

为了解免疫反应的变化，研究人员对黑质中的小胶质细胞进行了细致的分析。他们根据形态将Iba1阳性细胞分为四种类型：A型（静息/监视）、B型（高度分支化）、C型（肥大）和D型（阿米巴样）。在注射后1个月，各组WT小鼠黑质总小胶质细胞数量无显著差异，但PFF-STING^gt/gt小鼠已呈现双侧增加趋势。STING^gt/gt小鼠的PBS对照组中，监视性的A型小胶质细胞比例低于WT-PBS组。注射后6个月，STING^gt/gt小鼠在注射MONO或PFF后，黑质双侧小胶质细胞数量均显著增加，而WT小鼠无此变化。形态学分析显示，注射α-syn（无论单体或PFF）6个月后，两种基因型小鼠黑质同侧的肥大C型细胞比例均增加，监视性A型细胞比例下降。值得注意的是，只有PFF注射组（WT和STING^gt/gt）的同侧高度分支化B型细胞比例显著降低。此外，罕见的阿米巴样D型细胞在PFF注射6个月后更常见。这些说明α-syn注射引发了小胶质细胞向活化状态的转变，而STING缺失导致了更早和更持续的小胶质细胞增殖。

对吞噬活性标志物CD68的分析显示，在注射后1个月，PFF-STING^gt/gt小鼠纹状体的CD68表达显著高于其MONO和PBS对照组，也高于PFF-WT组。到6个月时，所有PFF注射小鼠的纹状体CD68表达均上调，且PFF-STING^gt/gt小鼠黑质的CD68表达也显著增加。主要组织相容性复合体II类分子（MHCII）在纹状体的表达在PFF注射1个月后于WT小鼠中增加，但在6个月时回归基线水平。这些数据表明，STING缺失背景下，PFF注射引发了更早、更强且更持续的吞噬性小胶质细胞反应。

PFF处理影响RNA表达和巨噬细胞活化

为了在分子层面刻画早期的免疫反应，研究人员在注射后1个月检测了多个脑区的免疫相关基因mRNA表达。在前额叶皮层，PFF-WT小鼠表现出TLR2、TLR4、补体因子C1q和TREM2等基因的上调，而PFF-STING^gt/gt小鼠仅见C1q上调，且其TLR2和TLR4的表达水平低于PFF-WT小鼠。在纹状体（注射部位），PFF-WT小鼠有IFN-β、IL-1β、TLR2、C1q、C4b、TREM2和PUMA的上调，而PFF-STING^gt/gt小鼠仅见TLR2、C1q和Mx1上调，且其CCL2、IL-1β、TLR2和TREM2的表达显著低于PFF-WT组。在腹侧中脑，PFF-WT小鼠反而表现出PUMA、C1q、C4b、Viperin和TREM2的下调，这主要是由于MONO-WT组这些基因的基础表达较高。此外，MONO-STING^gt/gt小鼠在多个脑区也显示出低于MONO-WT组的炎症因子表达。这些结果提示，大脑对PFF的免疫反应具有区域特异性，而STING功能的缺失削弱了细胞对单体性和纤维状α-syn产生免疫反应的能力。

PFF注射导致自噬受损和病理性α-syn积累

接下来，研究人员评估了α-syn病理和自噬相关蛋白的变化。免疫组化结果显示，PFF注射在两种基因型小鼠中均诱导了聚集态α-syn（MJF14阳性）和磷酸化α-syn（pSer129）在杏仁核、黑质、皮层和丘脑等区域的积累，这种病理随时间进展而加剧（例如，黑质的MJF14阳性信号在6个月时显著增加）。然而，在任何一个时间点或任何一个脑区，PFF-STING^gt/gt和PFF-WT小鼠之间的α-syn病理程度均无显著差异。同时，自噬衔接蛋白p62（SQSTM1）在PFF注射小鼠的黑质和杏仁核也出现积累，且同样不受STING基因型的影响。这表明，STING的缺失并未改变PFF诱导的α-syn病理负担和自噬相关蛋白p62的沉积。

长期PFF诱导的黑质纹状体变性在WT和STING^gt小鼠中相似

最后，研究人员评估了黑质纹状体多巴胺能通路的完整性。纹状体TH阳性纤维的光密度分析显示，在注射后1个月，PFF注射已在WT和STING^gt/gt小鼠中引起TH信号显著下降，且STING^gt/gt小鼠的下降趋势更为明显。然而，到6个月时，两种基因型PFF注射组的TH纤维损失程度变得相似。对黑质TH阳性神经元的立体细胞计数发现，在1个月时，PFF-WT小鼠的神经元数量尚无显著变化，而STING^gt/gt小鼠在注射MONO或PFF后已出现同侧TH+神经元减少。到了6个月，PFF注射在WT和STING^gt/gt小鼠中均导致了相似程度（约38-43%）的黑质TH+神经元丢失。这些数据说明，缺乏STING使得多巴胺能变性发生得更早，但长期的神经元损失程度在两种基因型间是相当的。

本研究通过系统的在体实验表明，在α-syn PFFs诱导的帕金森病小鼠模型中，STING信号通路的缺失虽然显著调节了大脑的免疫反应——表现为早期和持续的小胶质细胞增生、增强的吞噬活性（CD68表达）以及部分炎症因子（如TLR2、TLR4、IL-1β）表达的减弱——但并未能保护多巴胺能神经元免受最终退行性死亡的命运。缺乏STING的小鼠表现出更严重的运动行为障碍和更早出现的轴突损失，然而，α-syn的病理聚集（磷酸化和异常聚集）以及自噬标志物p62的积累并未受到影响，长期（6个月）的黑质神经元损失程度与野生型小鼠无异。因此，该研究结论并不支持STING在所使用的PFF-PD模型中介导α-syn诱导的神经元死亡中是必要因素。然而，研究结果强调了STING在大脑应对蛋白质异常聚集（无论是单体过载还是纤维化）的免疫应答中具有重要功能。STING缺失所导致的独特免疫微环境（炎症因子谱改变、小胶质细胞持续活化）可能影响了神经元的正常功能活动，从而产生了显著的、与神经元死亡程度不完全匹配的运动表型变化。这一发现提示，STING相关的免疫调节可能更多地与帕金森病的症状表现相关，而非直接决定神经元的生死。该研究增进了我们对神经免疫相互作用在帕金森病复杂病理进程中作用的理解，并为针对免疫通路进行症状调控而非神经保护的治疗策略提供了新的思路。