马疱疹病毒1型（EHV-1）感染原代小鼠星形胶质细胞：细胞骨架的关键作用及其在非完全性感染中的意义

《Archives of Virology》：Equid alphaherpesvirus 1 (EHV-1) infection of primary murine astrocytes: role of the cytoskeleton

本研究针对EHV-1神经嗜性机制不清及星形胶质细胞感染特性不明的问题，开展了EHV-1感染原代小鼠星形胶质细胞的细胞骨架作用研究。通过免疫荧光、qPCR及细胞骨架抑制剂实验，发现EHV-1可诱导星形胶质细胞形态改变和细胞骨架重组，病毒抗原沿肌动蛋白丝和微管分布，且细胞骨架破坏显著降低病毒DNA水平。两种EHV-1毒株均表现为非完全性感染，提示星形胶质细胞可能作为病毒潜伏场所。该研究为阐明EHV-1神经发病机制提供了新视角。

　　

在兽医学和病毒学领域，马疱疹病毒1型（EHV-1）一直是一个令人关注的病原体。这种神经嗜性病毒不仅在马群中引起呼吸道疾病、流产和幼驹死亡，还能导致致命的疱疹病毒性脑脊髓炎（EHM）。尽管马是EHV-1的主要宿主，但小鼠也被广泛用作研究该病毒神经致病机制的模型，因为两者在疾病模式和神经毒性方面表现出相似性。在小鼠中，EHV-1感染会导致严重的神经系统疾病、脑炎以及广泛的神经病理学改变，包括炎症浸润和大脑中高水平的促炎细胞因子。

星形胶质细胞作为中枢神经系统（CNS）中无处不在的细胞，承担着多种功能，包括促进神经元生长和存活，以及产生先天免疫反应以对抗入侵的病原体。病毒感染后，星形胶质细胞会经历显著激活，在介导神经炎症反应中发挥关键作用，这可能加剧CNS的病理损伤。先前的研究表明，几种人类疱疹病毒（HHVs），如HHV-1、HHV-2、HHV-4、HHV-5和HHV-6，能够在原代人星形胶质细胞中建立有效感染。然而，关于EHV-1能否在体外感染这类胶质细胞，目前尚无明确证据。免疫组织化学研究显示，在患有急性麻痹性疾病的马脑和脊髓中，不仅神经元内存在EHV-1抗原，星形胶质细胞中也检测到了该抗原，这表明在神经致病早期，星形胶质细胞可能与神经元一样，能够直接被EHV-1感染。尽管如此，EHV-1对星形胶质细胞的趋向性及其具体感染机制仍不清楚。

EHV-1采用多种策略感染不同宿主和细胞类型，其中包括对宿主细胞骨架的操纵。疱疹病毒几乎可以在其复制周期的每一步骤中对细胞骨架进行调控，从病毒进入细胞到病毒释放，以促进其传播。虽然细胞骨架重塑是α疱疹病毒的典型特征，但其具体机制和依赖性在该病毒亚家族中差异显著。例如，细胞骨架成分可能作为病毒运输的定向轨道，也可能在构成物理屏障时被主动破坏。此外，疱疹病毒还进化出通过细胞连接直接将子代病毒颗粒传递给邻近易感细胞的机制，从而规避细胞外释放，逃避免疫系统识别。

在先前的研究中，Anna Storska和Joanna Cymerys团队已经证明，EHV-1在感染原代小鼠神经元、多形性胶质母细胞瘤细胞系A172、马真皮细胞（ED）和Vero细胞时，严重依赖于微丝（肌动蛋白）和微管。基于这些发现，本研究进一步探讨了神经致病性和非神经致病性EHV-1毒株在体外感染原代小鼠星形胶质细胞的能力是否存在差异，并明确了宿主细胞骨架在这一感染过程中的作用。

为了开展这项研究，研究人员从7至10周龄的BALB/c小鼠中制备了原代星形胶质细胞培养物，细胞在胶质细胞生长培养基中培养，并接种于多聚赖氨酸/层粘连蛋白包被的玻片上。通过GFAP（胶质纤维酸性蛋白）免疫染色确认星形胶质细胞纯度超过99%。研究使用了两种EHV-1毒株：非神经致病性毒株Jan-E和神经致病性毒株EHV-1 26。细胞以感染复数（MOI）为1.0感染病毒1小时，随后在新鲜培养基中培养2、24和48小时。技术方法主要包括免疫荧光染色（检测病毒抗原、GFAP、肌动蛋白丝和微管）、细胞骨架抑制剂（拉春库林A、细胞松弛素D、诺考达唑）处理以及实时定量PCR（qPCR）检测病毒DNA水平。统计分析采用单因素方差分析和Tukey多重比较检验。

星形胶质细胞对EHV-1感染的易感性及病毒复制动力学

研究首先评估了原代小鼠星形胶质细胞对两种EHV-1毒株的易感性。双标免疫荧光和共聚焦显微镜显示，病毒抗原与GFAP（星形胶质细胞特异性细胞骨架蛋白）共定位。在模拟感染的星形胶质细胞中，GFAP形成致密的放射状网络，而EHV-1感染破坏了这一结构，并诱导了形态学改变。感染24和48小时后，星形胶质细胞常常失去其星形形态，变得肥大、圆润，且突起回缩。病毒抗原主要位于核周胞质中，48小时后在GFAP阳性突起中也检测到抗原。qPCR分析揭示了两种毒株在感染星形胶质细胞中不同的复制动力学。在感染EHV-1 26毒株的细胞中，病毒DNA拷贝数在感染后2小时和24小时显著下降，48小时略有回升。而在感染Jan-E毒株的细胞中，病毒DNA水平在感染后2小时在细胞内增加约1个对数单位，并在24和48小时保持较高水平。这些结果表明，部分EHV-1感染的原代小鼠星形胶质细胞无法完成有效感染，可能建立了非完全性感染状态，即病毒能感染细胞但无法产生子代病毒。

EHV-1感染对肌动蛋白细胞骨架的影响

EHV-1感染诱导了原代小鼠星形胶质细胞内肌动蛋白丝分布的多种变化。在模拟感染的细胞中，肌动蛋白丝形成皮层下的应力纤维，并可见隧道纳米管（TNTs）和丝状伪足等突出结构。感染后2小时即可观察到细胞骨架重塑，表现为核周区域应力纤维减少和变薄。病毒抗原在核周区域积累，并沿细肌动蛋白丝分布，提示肌动蛋白可能参与病毒运输。感染早期（2小时），沿肌动蛋白纤维的抗原可能代表正在向细胞核运输的进入病毒；而24小时后，病毒抗原与丝状伪足相关，暗示其在子代病毒细胞间传播中的潜在作用。共定位分析显示病毒抗原与F-肌动蛋白之间存在中等相关性（Pearson's r=0.4-0.55），Manders' M2系数（约0.9）表明大多数病毒抗原与F-肌动蛋白重叠。为研究肌动蛋白在感染中的作用，细胞在用细胞松弛素D或拉春库林A（肌动蛋白解聚剂）预处理后感染EHV-1。qPCR分析显示，这两种抑制剂均以浓度依赖的方式显著降低了两种毒株的病毒DNA拷贝数，其中Jan-E毒株对肌动蛋白干扰更为敏感。

EHV-1感染对微管细胞骨架的影响

在模拟感染的星形胶质细胞中，微管形成从细胞核辐射至细胞周边的连续网络。感染后2小时，未观察到主要结构变化，但病毒抗原沿微管蛋白纤维分布，主要位于细胞周边。24小时后，微管网络被破坏，尤其是在Jan-E毒株感染的星形胶质细胞中，出现明显的微管变细和解聚。EHV-1 26毒株感染也导致周边微管稀疏，但核周区域仍保留致密的α-微管网络，病毒抗原在此积累。Pearson相关系数（EHV-1 26：r=0.541和0.712；Jan-E：r=0.679和0.850）表明α-微管与病毒抗原之间存在强正相关，Manders' M1和M2系数（0.7-1.0）进一步证实了共定位。用微管破坏剂诺考达唑预处理细胞后感染EHV-1，qPCR显示病毒DNA水平显著降低，其中Jan-E毒株的抑制效果更为明显。

本研究证实了EHV-1能够在体外感染原代小鼠星形胶质细胞。神经致病性和非神经致病性毒株均能引起星形胶质细胞显著的形态学改变，破坏肌动蛋白丝和微管的组织结构。病毒抗原与细胞骨架成分的共定位提示后者在病毒运输中发挥作用。此外，破坏细胞骨架结构显著降低了病毒DNA水平，强调了细胞骨架在EHV-1感染早期阶段的重要性。尽管感染未导致完全的病毒复制，表明其可能建立了非完全性感染，但仍诱导了显著的形态学改变和细胞骨架重塑。这些发现拓展了我们对EHV-1在非神经元脑细胞中趋向性及细胞骨架相互作用的理解，强调了进一步研究星形胶质细胞感染在体内神经炎症和病毒潜伏中潜在作用的必要性。该研究为阐明EHV-1神经致病机制提供了新的实验依据，并为开发针对细胞骨架动态的抗病毒策略提供了潜在靶点。论文发表于《Archives of Virology》期刊，为病毒与宿主细胞相互作用领域增添了重要数据。