综述：推进蝶蛾类神经行为学研究的新兴工具

《Journal of Comparative Physiology A》：Emerging tools to advance neuroethology in butterflies and moths

本综述系统梳理了单细胞转录组测序（scRNA-seq）、空间转录组学、CRISPR基因编辑等新兴技术如何克服传统神经行为学研究的技术瓶颈，为利用蝶蛾类（Lepidoptera）丰富的生态适应性和行为多样性建立新型模型系统提供了路线图。文章重点探讨了这些工具在解析神经元类型多样性、神经环路功能及行为遗传基础方面的应用潜力，强调了将分子水平发现与生态进化背景相结合的研究策略。

　　

蝶蛾类动物凭借其惊人的行为多样性和深厚的生态学研究基础，正成为神经行为学研究的新兴模型。历史上，该领域主要在少数易操作的物种中进行精细的功能性研究，而生态学家和进化生物学家则更侧重于采用系统发育和比较的方法来揭示多样化的普遍规律。如今，随着分子测序技术及相关工具的涌现，在这两种传统之间架起桥梁的前景日益明朗。这些工具使得我们能够在组织或细胞特异性水平上调查细胞类型、定位其胞体空间位置、开发新的细胞类型标记物进行靶向分析，以及量化基因表达的动态调控。

分子工具研究蝶蛾神经多样性

理解神经系统如何产生行为是神经行为学的核心目标。神经元可以根据其形态、连接模式、分子身份和生理特性被划分为不同类型。传统上，蝶蛾类的神经细胞类型主要通过结合细胞内记录和示踪剂注射来表征，这种方法能精确可视化细胞形态和空间排列，但难以明确鉴定物种内和物种间的同源神经元类型。

单细胞或单细胞核测序技术的出现为识别神经细胞类型提供了新途径。这些方法根据每个细胞表达的基因及其表达水平形成细胞簇，从而以无偏见、可扩展且全面的方式对神经元类型进行全局评估。目前，在蝶蛾中应用scRNA-seq的研究仍较少，已知的研究主要集中于家蚕（Bombyx mori）的脑部，揭示了其幼虫和成虫阶段细胞组成的预期变化，以及病毒感染后脑细胞的基因表达变化。将分子细胞类型与解剖学信息整合是理解大脑架构的关键步骤。原位杂交链式反应（HCR）等多重方法可用于将特定细胞类型与其在神经或感觉系统中的空间位置联系起来。更为全局性的比较则受益于空间转录组学（sST）的发展，它能在保留空间信息的同时对目标组织进行全面的转录组分析。将分子细胞类型目录、通过空间转录组学获得的胞体位置以及投射组或连接组图谱相结合，尤其令人兴奋，这将促进比较连接组学的新进展。

神经细胞的动态基因调控

行为变异不仅仅是静态细胞和环路的产物，也是基因表达在特定情境下动态调控的结果。环境刺激、代谢状态和发育信号都会触发基因表达、染色质可及性以及表观遗传修饰的改变。在昆虫中，尽管整体DNA甲基化水平低于脊椎动物，但DNA甲基化和组蛋白修饰与生理和行为可塑性有关。

研究DNA甲基化的传统方法如全基因组亚硫酸氢盐测序，能够以单碱基分辨率精确绘制5-甲基胞嘧啶（5mC）在基因组中的分布。例如，在漆粉蝶（Vanessa cardui）中，食物压力被证明会改变头部组织全基因组的甲基化模式。长读长测序（LRS）技术，如PacBio和Oxford Nanopore Technologies（ONT）测序，提供了无需额外化学处理即可直接检测修饰核苷酸的新方法，为研究非模式生物的表观遗传调控提供了见解。例如，在草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）中，LRS全基因组DNA甲基谱揭示了农药耐受和敏感品系之间的甲基化差异。新的方法还允许在单细胞水平上对表观遗传特征（如DNA甲基化和DNA可及性）进行分析，为理解行为多样性的细胞或分子基础提供了新的可能。

自由活动蝶蛾神经生理记录技术的进展

为了深入了解蝶蛾如何感知世界、大脑如何整合多种环境线索以及这些线索如何用于控制各种行为，一系列成熟的神经生理学技术发挥了重要作用。

在静态蝶蛾中进行神经记录是经典方法。电触角图（EAG）及其与气相色谱联用（GC-EAD）已被应用于研究蝶蛾触角检测哪些嗅觉线索。单感器记录（SSR）则可用于定量研究触角嗅觉受体神经元（ORNs）的敏感性。在视觉方面，视网膜电图（ERG）揭示了眼睛光感受器的光谱敏感性，而细胞内单光感受器记录（SPR）则能分离出特定类型光感受器的光谱敏感性。此外，结合示踪剂注射的细胞内记录已被用于识别和生理表征大脑中的神经元，例如在天蛾（Manduca sexta）中首次描述了昆虫嗅觉的神经环路。

在活跃的蝶蛾中进行神经记录更能反映自然状态。最近的研究成功地对被拴住的帝王蝶（Danaus plexippus）进行了神经记录，它们可以在飞行模拟器中自由转向。通过同时观察定向行为和神经元活动，描述了帝王蝶太阳罗盘系统中不同的神经细胞类型。然而，目前无法在不同动物中可靠地对同一神经元进行记录。

基因编码工具为神经记录带来了革命。在果蝇中，利用分裂GAL4驱动品系，结合UAS介导的基因编码钙指示剂表达，可以在虚拟现实系统中通过光学双光子钙成像对特定细胞群的活动进行成像。虽然已有研究将飞行或行走的蝶蛾置于实验性虚拟现实系统中，但缺乏标记神经元的品系仍然是利用蝶蛾研究大脑功能的一个主要缺点。未来的蝶蛾神经行为学研究，将受益于细胞类型数据的增加、细胞类型特异性调控区域的生成以及更先进的遗传工具。

大脑与行为的遗传操控

对基因组进行操控以直接测试基因如何影响神经功能和行为，或可视化神经环路及其激活，是功能神经遗传学的关键。

在家蚕中，基于piggyBac转座酶系统的转基因协议发展已超过25年。这些技术为了解信息素嗅觉的感官基础提供了重要见解。例如，Sakurai等人克隆了参与信息素接收的嗅觉受体基因（BmOR1）的启动子，以驱动远缘物种小菜蛾（Plutella xylostella）的OR1直系同源基因的表达，实验成功引发了转基因家蚕雄性对小菜蛾信息素和活雌蛾的反应性。Fujiwara等人则培育了在BmOR1表达的嗅觉受体神经元中表达GCaMP2（一种基因编码的钙指示剂）的转基因家蚕，观察到对家蚕信息素脉冲的钙响应随浓度增加而增强。Hara等人进一步优化了GAL4/UAS系统，实现了神经元束的可视化、使用钙成像测量神经活动以及靶向神经元抑制。

CRISPR等可编程核酸酶也已成功应用于蝶蛾物种。它们可以在目标位点产生DNA双链断裂，并通过易错的非同源末端连接（NHEJ）通路进行修复，从而在编码基因内产生移码突变，获得蛋白质无效突变体。CRISPR敲除实验已被用于评估外周感觉系统以外的行为。例如，在帝王蝶中，昼夜节律钟基因（如Clock、Bmal1和Cry2）的功能丧失突变体消除了生殖输出的光周期反应，而ninaB1（维生素A通路中的限速酶）的CRISPR突变体揭示了其在独立于视觉功能的光周期响应中的作用。在Heliconius蝴蝶中，CRISPR-Cas9敲除regucalcin1基因破坏了雄性求偶行为，证实了其在交配行为中的作用。

将神经遗传学工具扩展到其他蝶蛾物种面临一些技术考虑，包括转基因个体的筛选策略、在难以长期维持转基因品系的物种中简化系统（如使用Q系统）、避免内源性转座子再移动带来的基因组不稳定性、提高CRISPR敲入大片段的有效性，以及通过基因分型和控制杂交来获得纯合修饰个体等。

结论与展望

蝶蛾类为推进我们对行为神经基础的理解提供了许多机遇，而为新的研究系统开发资源的挑战现在也变得更为可行。一个富有成效的神经行为学案例研究计划可以包括：识别具有显著新颖性或极端表型的行为目标；在系统发育框架内评估其生态背景；开发基因组资源（包括高质量基因组组装和注释）；利用大脑图谱和比较生物学来指导神经活动检测；通过群体基因组学、转录组学或定量遗传学识别候选遗传机制；最后利用转基因方法（如CRISPR敲除、等位基因替换、报告基因构建体）测试机械性假设。通过整合这些方法，并利用蝶蛾类丰富的自然历史数据，研究者可以充分利用这些昆虫的行为和神经多样性，深化我们对大脑功能与进化之间联系的理解。