光学生物传感器检测霍乱弧菌的研究进展：从基础原理到现场应用新策略

《IEEE Sensors Reviews》：Advancements in Detection of Vibrio Cholerae Based Optical Biosensors

本文系统评述了基于光学生物传感器的霍乱弧菌检测技术最新进展，聚焦于解决传统方法在快速性、灵敏度和现场部署方面的不足。研究人员详细分析了侧向流动分析、表面等离子体共振、光纤传感等多种光学平台，总结了其在检测限、线性范围等关键性能参数上的优劣，并指明了面向现场快速诊断的未来发展方向，对传染病防控具有重要意义。

　　

在全球公共卫生领域，霍乱依然是一个严峻的挑战。这种由霍乱弧菌（Vibrio cholerae, VC）引起的急性腹泻疾病，主要通过受污染的水或食物传播，在世界卫生组织（WHO）的统计中，每年估计有130万至400万病例，导致2.1万至14.3万人死亡，而实际负担可能因漏报而更高。传统的检测方法，如细菌培养和聚合酶链式反应（PCR），虽然特异性高，但耗时长、需要专业的实验室环境和人员，难以在资源有限或疫情暴发现场进行快速响应。特别是在霍乱这类潜伏期短、需要紧急干预的疾病面前，开发便携、快速、高灵敏的检测工具显得尤为迫切。

在此背景下，生物传感器技术应运而生，成为病原体检测的强大工具。它们将高特异性与微型化、实时分析的潜力相结合。其中，光学生物传感器因其无标记检测、响应快速、便携性好以及与现场快速诊断（Point-of-Care, PoC）场景兼容等优势，受到了广泛关注。它们通过检测荧光、吸光度、发光或折射率等光学现象的变化，将生物分子结合事件转化为可量化的信号。

为了系统梳理这一领域的进展，Zahra Davarjou 和 M.H. Shahrokh Abadi 在《IEEE Sensors Reviews》上发表了综述文章《Advancements in Detection of Vibrio Cholerae Based Optical Biosensors》。该研究旨在批判性地评估用于霍乱弧菌检测的光学生物传感器技术的最新进展，重点考察换能器类型、生物识别元件以及信号放大策略，并对比不同平台的性能，讨论当前面临的挑战以及未来的战略方向。

为开展此项综述研究，作者们系统检索和分析了大量已发表的科学文献，涵盖了多种光学生物传感技术。研究的关键方法包括对不同技术平台的性能参数进行系统比较，特别是检测限（Limit of Detection, LoD）、线性范围（Linear Range）和灵敏度（Sensitivity）。这些比较基于已报道的实验数据，涉及对特定生物识别元件（如抗体（Abs）、核酸、适体（Aptamer））与不同光学 transduction 机制（如表面等离子体共振（SPR）、荧光、光纤传感等）结合的效果评估。

II. LFA-BASED OPTICAL BIOSENSORS

侧向流动分析（Lateral Flow Assays, LFAs）已被证明在霍乱弧菌的快速检测中非常有效，特别是在疫情爆发和资源有限地区。研究表明，例如莫桑比克巴斯德研究所的试纸条测试，与培养方法相比，灵敏度约为95%，特异性接近89%。更近期的进展，包括重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification, RPA）与LFA联用，在食品样品中实现了低至每10克1 CFU（菌落形成单位）的检测限，仅需数分钟，凸显了其在疫情响应和食品安全监测中日益重要的作用。LFA的广泛应用主要归因于其简单且可扩展的设计，能够实现低成本大规模生产。然而，传统的LFA也存在一些局限性，包括灵敏度相对较低、结果难以量化以及多重检测能力有限。近年来，通过将LFA与先进的光学检测技术（如荧光、化学发光）集成，其分析性能得到了显著增强。

III. SPR-BASED BIOSENSORS

表面等离子体共振（Surface Plasmon Resonance, SPR）生物传感技术自问世以来，因其无标记检测、可重复使用以及快速、准确的响应而受到广泛关注。SPR的基本原理涉及表面等离子体（一种在金属-电介质界面发生的自由电子集体振荡）的激发。当p偏振光以特定角度照射金属薄膜时，其能量可以转移到金属表面的自由电子，导致反射光强度在共振角（Resonance Angle, RA）处出现特征性下降，这种角度偏移构成了SPR生物传感的基础。SPR生物传感的基本机制包括一系列明确的步骤：首先，通过固定识别层（如抗体、核酸或适体）对金属表面进行修饰；接着，将目标分析物引入功能化表面，发生特异性结合；此结合事件会引起传感器界面局部折射率的变化；最后，SPR仪器通过监测共振角、波长或强度等参数的偏移来检测这些变化，并将偏移幅度与分析物浓度或其结合动力学定量关联。

棱镜耦合SPR是最经典和商业化的配置，例如Biacore平台。为了克服棱镜基系统的笨重性，人们开发了光栅耦合SPR（Grating-coupled SPR），它利用周期性金属纳米结构来衍射光并直接激发等离子体，从而无需棱镜并促进芯片化制造。局部表面等离子体共振（Localized Surface Plasmon Resonance, LSPR）是当入射光与金属纳米颗粒（Metallic Nanoparticles, MNPs）相互作用时发生的一种光学现象，它诱导其导带电子的相干振荡。与SPR的传播表面等离子体波不同，LSPR中的等离子体局限于纳米级金属结构。LSPR基于生物传感无需棱镜或复杂的光学元件，因此便于携带且适合PoC应用。然而，LSPR的传感深度非常短（距纳米颗粒表面约10-30纳米），这要求识别层必须很薄，且结合的目标物必须足够靠近纳米颗粒表面。该领域的显著进展还包括表面等离子体共振成像（Surface Plasmon Resonance Imaging, SPRi），它通过实现对阵列传感器表面结合事件的空间映射，扩展了传统SPR的功能。进一步的进展包括混合和信号放大的SPR生物传感器，它们将等离子体传感与放大策略（如纳米颗粒标记、磁珠、酶促沉淀或与二维材料（如石墨烯）集成）相结合。这些系统提高了灵敏度，能够实现超低检测限（低至几个CFU/mL）。

IV. FIBER-OPTICS-BASED BIOSENSORS

光纤生物传感器基于斯涅耳定律和全内反射（Total Internal Reflection, TIR）原理作为光学换能器。光在纤芯（折射率高于包层）中传播。一部分导光以倏逝场的形式延伸到纤芯之外，其穿透深度为几百纳米，并随距离呈指数衰减。当倏逝场与周围介质相互作用时，它可以与表面结合的物种（如与生物分子连接的荧光团）耦合，从而通过导模激发并随后收集其荧光发射。光纤也可作为多功能波导与其他光学 interrogation 技术集成，例如光纤表面等离子体共振（Fiber-Optic Surface Plasmon Resonance, FO-SPR）传感器。在FO-SPR中，光纤提供光传输和等离子体激发，提供了一个紧凑且便携的棱镜系统替代方案，使其成为PoC测试的理想选择。尽管具有这些优势，光纤生物传感器也面临显著的缺点。制造复杂性，尤其是纳米结构设计，仍然是一个主要挑战。在恶劣生物环境中的长期稳定性、随时间推移的信号衰减、对专用 interrogation 系统的需求以及高生产成本限制了其大规模临床部署。然而，生物相容性材料、制造技术和信号处理算法方面的创新进步继续推动着光纤在生物传感领域所能达到的边界。

V. MICROFLUIDIC-BASED BIOSENSORS

微流控是一项关键技术，它使用微尺度通道来精确操纵和处理微小体积的流体。虽然聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane, PDMS）是制造微流控器件最常用的基底，但聚碳酸酯、聚烯烃、硅、玻璃、布料和纸等其他材料也越来越多地被用于此目的。电化学微流控生物传感器是开发最广泛的，因其尺寸小、制造成本低和令人满意的分析性能。然而，光学微流控生物传感器通常比电化学对应物具有更高的灵敏度。在这些系统中，检测区内集成激发光源使得能够量化分析物引起的光强或波长变化，并直接与分析物浓度相关联。当与表面等离子体共振（SPR）、荧光或表面增强拉曼散射（Surface-Enhanced Raman Scattering, SERS）等光学技术结合时，微流控平台进一步促进了多重化、自动化和高通量分析。

芯片实验室（Lab-on-Chip, LoC）是一种通过在小平台上构建流体微通道来同时执行多个实验室操作的器件。离心微流控芯片（Lab-on-Compact-Disk, LoCD）是一种LOC技术，其中微通道直接制造在CD上。CD旋转产生的离心力用于驱动流体通过这些通道。微流控生物传感器面临一些限制其广泛采用的挑战。它们的制造通常需要先进的微纳加工设施，而与光学元件的集成增加了系统复杂性和成本。此外，传统微流控系统通常依赖外部泵进行精确流体控制；然而，更简单或PoC设备可以使用被动流动机制（如毛细管作用）来驱动流体，而无需增加复杂性或成本。复杂样品（如粪便）引起的微通道堵塞或污染也会影响性能和可靠性。因此，尽管具有高灵敏度和多功能性，微流控生物传感器的商业应用程度仍低于侧向流动分析（LFA）等更简单的平台。

VI. PHOTONIC CRYSTAL-BASED BIOSENSORS

光子晶体（Photonic Crystal, PC）结构以其在电磁波长尺度上的周期性介电结构为特征，能够精确控制光传播，因此非常适合于无标记生物传感应用。当硅片被图案化成周期性孔洞晶格时，会形成光子带隙（Photonic Band Gap, PBG），允许某些光学模式传播而禁止其他模式。这种操纵电磁波的独特能力构成了将光子晶体集成到各种传感平台的基础。多孔硅（Porous Silicon, PSi）由于其简单的制造工艺和与硅基技术的兼容性，对于低成本、一次性生物传感器具有吸引力。然而，其商业应用受到重大挑战的阻碍。材料的高表面反应性使生物受体的稳定功能化复杂化，常常导致生物分子不稳定性。此外，其固有的机械脆性引起了对器件鲁棒性和重现性的担忧。因此，尽管研究前景广阔，PSi生物传感器在很大程度上仍局限于实验室环境。PSi生物传感的原理依赖于从PSi薄膜顶部和底部界面反射的光的相位差，这会在反射光谱中产生由薄膜光学厚度决定的干涉图案。当分析物与固定在孔壁上的受体结合时，材料的平均折射率增加，从而增加其光学厚度。

VII. FLUORESCENT BIOSENSORS BASED ON NPS

纳米颗粒（Nanoparticles, NPs）在纳米材料系统中的使用导致了许多信号换能器的发展。贵金属纳米颗粒由于其能够制造成各种形状、高消光系数和易于表面功能化，已被广泛用于各种传感器应用。功能化纳米颗粒通过将分子结合事件转化为可测量的光学信号，在生物传感器中充当高灵敏度换能器。例如，探针共轭的金纳米颗粒（Gold Nanoparticles, AuNPs）会发生目标物诱导的聚集或局部折射率变化，产生可见的颜色变化（比色法）或其表面等离子体共振（SPR）的改变。这些相同的金属纳米结构也为表面增强拉曼光谱（SERS）等技术提供了巨大的信号增强，而其他类型，如磁性纳米颗粒（Magnetic Nanoparticles, MNPs），则用于通过分离和浓缩步骤来提高测定效率。使用纳米颗粒和量子点（Quantum Dots, QDs）最常见的方法之一是FRET（F?rster Resonance Energy Transfer）方法，这是一种基于距离的能量转移现象，其中能量从高能荧光团转移到低能荧光团。该方法通常用于临床应用，如癌症治疗、适体分析、霍乱弧菌等病原体检测，因为它可以检测埃到纳米级别的变化。然而，也存在一些局限性，包括因聚集和氧化导致的不稳定性，这会降低其光学性能。性能也对纳米颗粒尺寸、形状和表面化学的变化高度敏感，使得重现性变得困难。最后，在复杂的真实样品中，非特异性结合常常会污染传感器，降低其特异性和可靠性。

VIII. QD-BASED BIOSENSORS

半导体量子点（Quantum Dots, QDs）是通常由周期表II-VI、III-V或IV-IV族元素组成的纳米级胶体纳米颗粒。这些纳米结构表现出独特的电光特性，使其非常适合生物传感应用。QD基生物传感器根据其信号产生和转导机制可分为四种主要类型：（i）荧光型，在外部光源激发下发光；（ii）生物发光型，通过酶催化生化反应产生光；（iii）化学发光型，作为化学反应的结果发光，无需酶；（iv）光电化学型，将光能转换为电信号进行检测。与传统的荧光蛋白和有机荧光团相比，QDs具有显著优势，最明显的是其可调谐的光学特性，例如尺寸依赖的发射光谱，这使得能够通过使用不同尺寸的QDs同时检测样品中的多个目标。它们还具有高度的稳定性、宽的带隙和出色的荧光特性，使其适用于1-20纳米波长范围内的体内成像、诊断和光电器件。此外，生物合成的QDs由于其简便且环保的方法，是化学合成QDs的可行替代品。尽管前景广阔，QD基生物传感器也面临一些局限性。重金属（如镉（Cd）和铅（Pb）的存在引发了毒性担忧，限制了它们的直接临床应用。此外，QDs通常需要表面修饰以确保在水环境中的生物相容性和稳定性，这增加了复杂性和成本。一个可能的解决方案是开发无镉QDs（如碳、硅或石墨烯QDs）结合先进的表面功能化技术，以增强生物相容性同时降低毒性。大规模生产高质量、可重现的QDs仍然昂贵，对广泛应用构成挑战。

IX. OTHER FLUORESCENT/LUMINESCENT-BASED BIOSENSORS

荧光标记或荧光释放反应可以独立使用或与其他比色或显微诊断方法结合使用来检测分析物。就生物识别元件而言，它们通常配备探针DNA，尽管也引入了其他类型，如抗体（Abs），这些通常由标记物或标签的类型选择。

X. DISCUSSION

A. Vibrio cholerae detection approaches

霍乱弧菌的检测依赖于多种方法，这些方法在速度、灵敏度和实用性上各不相同。传统的培养方法，如在硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆汁盐-蔗糖（TCBS）琼脂上生长以及随后的生化或血清学确认，仍然是诊断的金标准，尽管它们劳动密集且耗时。显微镜技术（如暗场检查和革兰氏染色）可提供快速的初步结果，但缺乏特异性。免疫学测定法，包括快速诊断测试（RDTs）、酶联免疫吸附测定（ELISA）和乳胶凝集，已被开发用于现场快速检测。虽然RDTs提供速度和简便性，但其灵敏度和特异性各不相同，性能通常在富集步骤后得到改善。更先进的分子方法，如PCR、定量PCR（qPCR）和环介导等温扩增（LAMP），提供了对产毒菌株的高灵敏度和特异性检测，并越来越多地用于临床和环境监测。基因组方法，特别是全基因组测序（WGS），为菌株分型、抗菌素耐药性和疫情动态提供了全面的见解，尽管它们仍然资源密集。霍乱疫情爆发期间对快速可靠诊断的迫切需求，加上PoC项目的扩展，推动了生物传感器的引入和进步。新兴技术现在涵盖LFA、电化学平台和先进的光学换能器，这是本综述的主要焦点。这些系统提供了快速、灵敏和便携的VC检测，使其成为实时监测和有效疫情管理的重要工具。

B. Biosensing in detection of Vibrio cholerae

已经开发了各种检测方法，主要侧重于电化学方法以及光学技术，如光学光谱和荧光显微镜。通常，荧光和比色方法通常是定性的，除非与定量策略结合，否则准确性较低。LFA生物传感器被认为是一种实用且易于使用的解决方案，特别是对于开发PoC应用。这是因为它们易于制造、成本低、便携且用户友好。然而，需要注意的是，这些生物传感器是一次性的，并且它们通常基于定性的颜色变化来检测目标分析物。通过集成合适的读取器技术，例如光学LFA系统，也可以获得定量测量。SPR生物传感器自问世以来就因其无标记检测能力、洗涤后可提供可重复结果以及快速、准确的响应时间而受到广泛关注。此外，通过定向固定生物受体、与纳米颗粒集成以及使用二维层等技术，可以进一步提高灵敏度。尽管有这些优点，它们的制造成本高昂，并且需要输入光束来激发等离子体。光纤波导由于几个关键优势为生物传感提供了增强的机会。这些优势包括抗信号干扰、远程传输信号的能力、灵活性、成本效益高的制造以及抗大气干扰能力。这些特性使光纤波导特别需要输入光束的技术（如表面等离子体共振（SPR））兼容。流体光学生物传感器的生产通常成本高昂且需要专用设备。然而，通过利用大规模生产技术，使用更便宜和可再生的材料和工艺，可以克服这一挑战。这种方法仍然可以确保关键优势，如高精度、快速响应时间和低样品消耗。光子晶体用于显示反射光的光谱图案。然而，多孔硅通常被认为是一种更具成本效益且易于制造的替代品。它允许通过洗涤重复使用，但其固有的孔隙率限制了其在多生物受体方面的应用。纳米颗粒和量子点（QDs）通常用作检测元件以产生荧光或提高灵敏度。QDs尤其具有若干独特优势，包括高稳定性、抗光漂白性、宽吸收窄发射光谱以及可调谐的光学特性。这些特性使得能够在单个分析物中进行多重检测。

VC生物传感器可用于疾病检测、水传和食源性质量监测以及环境监测以防止恐怖袭击。使用生物传感器检测病原体可以在不同的目标产品概况（Target Product Profile, TPP）级别上进行，包括：家庭（TPP1）、社区（TPP2）、诊所（TPP3）、外部实验室（TPP4）和医院（TPP5）。尽管已经引入了不同类型的PoC系统，但LFA是唯一具有在从TPP1到TPP5的不同级别上使用的独特能力的检测平台。然而，由于临床和医院级别需要可重现、鲁棒和灵敏的响应，微流控和SPR生物传感器似乎也是有吸引力的选择。在家庭级别，LFA仍然是最佳选择，因为它简单、成本低且易于使用，用于食品质量安全的“一次性”分析。另一方面，对于水质的长期监测和控制以及预防恐怖袭击，需要能够工作数天或数周的生物传感器功能，用于“长期监测”分析。这需要鲁棒、实时和高灵敏度的传感平台。微流控和光纤传感器似乎是这些应用的有前途的选择，尽管微流控和光子晶体平台也是多重检测的可行选择。

C. Limitations of the Current Technologies

当前技术存在平台特异性限制和跨平台通用限制。平台限制包括