miR164e-NAC32模块通过翻译后调控DELLA蛋白稳定性协调玉米株高

《Plant Communications》：The miR164e-NAC32 module orchestrates maize plant height by post-translational regulation of DELLA protein stability

本研究针对玉米倒伏问题，研究人员聚焦miR164e-NAC32-DELLA调控网络，发现ZmmiR164e通过抑制ZmNAC32表达，而ZmNAC32直接结合DELLA蛋白ZmD8的K399位点，屏蔽其泛素化降解，稳定ZmD8蛋白，从而抑制赤霉素(GA)响应性细胞壁生物合成基因(EXP、XTH、LAC等)，最终调控玉米节间伸长和株高，为作物株型精准育种提供了新靶点。

　　

玉米作为重要的粮食作物，其产量和机械化收获受到倒伏问题的严重制约。倒伏的主要原因之一是基部节间过度伸长，导致节间段过长、强度不足。优化植株结构、精确调控节间伸长，对于提高茎秆质量和抗倒伏能力具有重要的理论和实践价值。植物节间伸长受到多种植物激素的复杂调控，其中赤霉素(Gibberellin, GA)是促进茎秆伸长的关键激素。然而，关于microRNA（微小核糖核酸）如何与赤霉素信号通路交叉对话，特别是通过翻译后机制精细调控节间伸长的分子网络，目前尚不清楚。

为了揭示这些机制，研究人员在《Plant Communications》上发表了题为“The miR164e-NAC32 module orchestrates maize plant height by post-translational regulation of DELLA protein stability”的研究论文。该研究解析了一个层级式的miR164e-NAC32-DELLA调控网络，阐明了其在玉米茎秆发育中的关键作用。

研究主要应用了遗传学分析（构建转基因过表达和功能缺失材料）、分子生物学技术（双荧光素酶报告基因检测、酵母双杂交、双分子荧光互补、荧光素酶互补成像、免疫共沉淀、蛋白质体外降解和Pull-down实验）、细胞生物学技术（亚细胞定位、扫描电镜、石蜡切片）、转录组测序(RNA-seq)以及生物信息学分析（蛋白质三维结构建模）等关键技术方法。研究材料主要为转基因玉米植株，包括以玉米自交系18-599（红色生态型）为遗传背景的miR164转基因植株，以及以玉米自交系ND101为遗传背景的ZmNAC32转基因植株。

ZmmiR164e调控玉米节间伸长

研究首先证实了ZmmiR164e对玉米株高的负向调控作用。过表达ZmmiR164e的玉米株高和穗位高略有增加，而功能缺失（STTM）株系则表现出显著的矮化表型。对地上部节间长度的详细测量发现，过表达株系的第6至第10节间长度显著增加，而功能缺失株系的所有节间均显著缩短。扫描电镜观察显示，ZmmiR164e通过影响节间细胞长度来调控节间伸长，细胞长度与节间长度呈极显著正相关。然而，内源激素水平检测表明，ZmmiR164e并非通过改变赤霉素、生长素等激素含量来发挥作用。

ZmNAC32是ZmmiR164e的直接切割靶标

通过靶基因预测和验证，研究确定ZmNAC32是ZmmiR164e的直接作用靶标。在ZmmiR164e过表达植株中，ZmNAC32的转录水平下调，而在功能缺失植株中则上调。双荧光素酶报告基因实验进一步证实，ZmmiR164e能特异性抑制含有其靶位点的ZmNAC32报告基因的活性，而当靶位点发生同义突变时，这种抑制效应消失。

ZmNAC32抑制玉米节间伸长

表型分析发现，过表达ZmNAC32导致玉米株高和穗位高显著降低，节间变短，但其节间数目没有变化。石蜡切片结果显示，ZmNAC32过表达抑制了节间皮层细胞和薄壁细胞的伸长。相反，利用CRISPR/Cas9技术获得的ZmNAC32敲除突变体则表现出株高和节间长度的轻微增加。这些遗传证据证实了ZmNAC32在抑制玉米节间伸长中的作用，并且与ZmmiR164e对其的负调控关系在遗传上相互印证。

ZmNAC32通过相互作用参与GA信号通路

为了阐明ZmNAC32的作用机制，研究人员对ZmNAC32突变体和过表达株系进行了转录组分析。结果发现，赤霉素生物合成和信号通路核心基因的转录水平并未发生改变，但大量下游GA响应基因的表达显著变化。基因本体(Gene Ontology, GO)富集分析显示，在ZmNAC32过表达植株中下调的基因显著富集于细胞壁组织和生物合成相关通路，包括木葡聚糖内转葡糖基酶/水解酶(XTH1, XTH5, XTH13)和漆酶(LAC11)等细胞壁松弛和合成关键基因。鉴于ZmNAC32定位于细胞核，研究人员推测其可能通过蛋白质相互作用来调控这些GA响应基因。酵母双杂交实验发现ZmNAC32与赤霉素信号通路的关键负调控因子——DELLA蛋白ZmD8存在相互作用。这一结果随后通过双分子荧光互补和荧光素酶互补成像实验得到了进一步验证。

ZmNAC32通过物理屏蔽K399位点稳定ZmD8

转录组数据显示ZmD8的mRNA水平没有变化。酵母单杂交和启动子-荧光素酶报告基因实验表明ZmNAC32对ZmD8启动子没有直接的转录调控活性。然而，蛋白质免疫印迹分析显示，在ZmNAC32过表达材料的节间中，ZmD8蛋白水平升高，而在功能缺失株系中则降低。细胞体外降解实验表明，从ZmNAC32过表达材料中提取的蛋白质提取物能更慢地降解GST标记的ZmD8蛋白，说明ZmNAC32能够稳定ZmD8蛋白。通过酵母双杂交鉴定出ZmNAC32与ZmD8的GRAS结构域相互作用。对ZmD8蛋白已知的泛素化降解位点（K399和K463）进行点突变，并结合蛋白质三维结构模型预测，发现K399位点位于互作界面。荧光素酶互补成像和体外Pull-down实验证实，ZmNAC32与ZmD8的相互作用依赖于K399位点，K399突变完全破坏了二者的结合。在玉米原生质体中共表达实验表明，Flag标记的ZmNAC32能够提高HA标记的ZmD8的蛋白积累量，而HA标记的ZmD8^K399（K399突变体）即使在没有ZmNAC32的情况下也表现出更高的蛋白稳定性，提示K399突变可能本身就增强了蛋白稳定性。这些结果综合表明，ZmNAC32通过直接结合ZmD8，并物理屏蔽其关键的K399泛素化位点，从而阻止ZmD8被泛素化降解，起到稳定ZmD8蛋白的作用。

研究结论与意义

该研究揭示了一个全新的miRNA-NAC-DELLA调控模块在协调玉米株高中的作用机制。具体而言，ZmmiR164e通过转录后抑制其靶基因ZmNAC32的表达。ZmNAC32蛋白不直接调控转录，而是通过蛋白质相互作用，直接结合DELLA蛋白ZmD8，并通过屏蔽其K399降解位点来稳定ZmD8蛋白。稳定的ZmD8蛋白进而抑制下游赤霉素响应性细胞壁生物合成基因的表达，最终负调控节间细胞伸长和植株高度。这项研究的重要意义在于：首先，它发现了一种不依赖于NAC转录因子典型转录调控活性的新功能，即通过蛋白质相互作用稳定关键调控因子；其次，它阐明了miRNA通过精细调控靶基因表达，进而通过翻译后修饰层面交叉对话激素信号通路的复杂网络，为理解植物形态建成的多层次调控提供了新视角；最后，该研究鉴定的miR164e-NAC32-DELLA模块为玉米乃至其他禾谷类作物的株型改良和抗倒伏育种提供了潜在的重要分子靶标，具有重要的应用前景。未来的研究可以进一步探索ZmNAC32干扰SCF^SLY1/GID2E3泛素连接酶介导的ZmD8泛素化途径的具体分子细节。