ENT3：一种调控尿酸处置与巨噬细胞炎症的溶酶体尿酸转运蛋白

《iScience》：ENT3: A lysosomal urate transporter regulating urate disposition and macrophage inflammation

本刊推荐：为解决细胞内尿酸清除机制不明的问题，研究人员开展了关于溶酶体膜蛋白ENT3 (SLC29A3) 转运尿酸功能的研究。结果表明，ENT3是一种质子偶联的低亲和力、高容量尿酸转运蛋白，可将尿酸从溶酶体排出。在巨噬细胞中，ENT3通过双重调控尿酸和腺苷的转运来影响NLRP3炎症小体的活化。该研究揭示了细胞内尿酸稳态调控的新机制，为痛风等尿酸相关疾病的发病机制提供了新见解。

　　

在人体内，尿酸是嘌呤代谢的最终氧化产物。当血液中尿酸浓度超过饱和点（约400 μM或7 mg/dL）时，会形成尿酸钠（MSU）结晶，这些结晶沉积在关节等处，可引发剧烈的炎症反应，这就是痛风的由来。然而，一个有趣的现象是，并非所有高尿酸血症患者都会发展为痛风。这提示我们，除了血液中的尿酸水平，细胞内部，特别是免疫细胞（如巨噬细胞）如何处理尿酸，可能对疾病的发生起着关键作用。当巨噬细胞吞噬MSU结晶后，结晶会被运送到溶酶体中进行处理。如果溶酶体能够高效地将尿酸“泵出”，就可能促进结晶的溶解，避免持续的溶酶体损伤和炎症反应。那么，这个负责“泵出”尿酸的关键分子是谁？其机制又如何？这项发表于《iScience》的研究为我们揭开了谜底。

研究人员综合运用了分子生物学、细胞生物学和免疫学等多种关键技术方法。核心实验体系包括使用HEK293细胞进行ENT3蛋白的异源表达和功能表征，以及使用PMA诱导分化的THP-1巨噬细胞样细胞模型研究ENT3在生理相关环境下的功能。关键技术涉及利用定点突变构建质膜定位的ENT3-AA突变体进行直接的转运动力学分析；通过放射性同位素标记的底物（如[1?C]尿酸和[3H]腺苷）摄取实验评估转运活性；采用差速离心法分离溶酶体组分以研究溶酶体内的尿酸积累；通过蛋白质印迹（Western Blot）和免疫荧光技术验证蛋白表达与定位；利用小干扰RNA（siRNA）在THP-1细胞中敲低ENT3以研究其功能缺失效应；并通过酶联免疫吸附测定（ELISA）检测炎症因子白细胞介素-1β (IL-1β)的分泌水平。

ENT3尿酸转运活性的鉴定

研究人员首先设计巧妙的实验来探究ENT3是否具有尿酸转运功能。他们在HEK293细胞中表达能将尿酸主动泵入细胞的钠依赖性核苷转运蛋白1（SNBT1），导致溶酶体内[1?C]尿酸积累增加。当共表达ENT3时，溶酶体内的尿酸积累显著减少，提示ENT3可能介导了尿酸从溶酶体中的外排。为了直接证明ENT3的转运能力，研究团队构建了一个关键工具：ENT3-AA。该突变体将ENT3氨基末端的双亮氨酸（L31L32）溶酶体靶向基序替换为丙氨酸，从而使其错误定位至细胞膜上。这使得研究人员能够像研究普通膜转运蛋白一样，直接在细胞培养液中检测其功能。结果发现，在酸性（pH 5.0）条件下，表达ENT3-AA的细胞对[1?C]尿酸的摄取显著高于对照细胞，而表达野生型ENT3（定位于溶酶体）的细胞则无此现象，证实了ENT3-AA在质膜上具有功能活性。ENT3-AA同时也保留了转运[3H]腺苷的能力，表明其核苷转运功能未被破坏。

ENT3-AA介导的尿酸转运的功能特性分析

接下来，研究人员对ENT3-AA的转运特性进行了深入表征。研究发现，ENT3-AA介导的尿酸摄取具有强烈的pH依赖性，在pH 4.5时活性最高，随着pH值升高而降低，在pH ≥ 6.0时活性与背景水平相当。使用质子载体（如CCCP和FCCP）破坏质子梯度后，尿酸转运被显著抑制，证明ENT3的尿酸转运是质子偶联的。离子替换实验表明，其活性不依赖于Na?、K?或Cl?。动力学分析显示，ENT3-AA介导的尿酸转运符合米氏方程，其米氏常数（K_m）约为1.15 mM，最大转运速率（V_max）为2.65 nmol/min/mg protein，表明ENT3是一种低亲和力、高容量的尿酸转运蛋白。这个K_m值高于溶酶体内可能出现的尿酸浓度，意味着即使在MSU结晶溶解导致局部高浓度的情况下，ENT3也能有效工作。此外，研究还测试了多种化合物对ENT3的抑制效果。经典的ENT抑制剂双嘧达莫和硝基苄基硫代肌苷（NBMPR）能有效抑制尿酸转运，半数抑制浓度（IC₅₀）分别为7.71 μM和21.7 μM。而生理浓度的核苷、核苷碱基以及临床常用的降尿酸药物（如苯溴马隆、丙磺舒）在治疗浓度下对ENT3的抑制效应较弱。

ENT3基因变异对尿酸转运的影响

SLC29A3基因（编码ENT3）的突变与多种罕见遗传性疾病（如H综合征、Rosai-Dorfman病等）相关，这些疾病常伴有免疫失调。本研究评估了多种疾病相关ENT3突变体对尿酸转运功能的影响。将致病突变引入ENT3-AA背景后，除N334S突变体仍保留部分活性外，其余测试的突变体（如M116R, R134C, R363Q等）的尿酸转运活性均完全丧失。蛋白质印迹和免疫荧光分析表明，活性丧失并非完全由于蛋白表达量下降或错误定位所致，许多突变体在正常表达和定位的情况下仍无功能，提示突变直接影响了转运机制。基于AlphaFold2预测的ENT3结构模型显示，导致功能丧失的错义突变位点主要集中在预测的跨膜螺旋区域，这些区域通常对转运功能至关重要。

ENT3在分化THP-1细胞中调节尿酸积累和炎症反应的作用

为了探究ENT3在更接近生理条件下的功能，研究团队使用了人单核细胞系THP-1，并用佛波酯（PMA）将其诱导分化为巨噬细胞样细胞。他们发现，在分化过程中，ENT3的mRNA表达显著上调，提示其在巨噬细胞功能中可能发挥重要作用。通过siRNA技术敲低分化后THP-1细胞中的ENT3，研究人员观察其对MSU结晶处理后的反应。在让细胞吞噬[1?C]标记的MSU结晶后，继续培养发现，ENT3敲低细胞在24小时和48小时后，细胞内残留的[1?C]尿酸水平显著高于对照细胞。这表明ENT3的功能缺失损害了细胞清除由吞噬的MSU结晶溶解所产生的尿酸的能力，支持了ENT3在溶酶体尿酸外排中的作用。然而，在炎症反应方面，结果却更为复杂。与对照细胞相比，ENT3敲低细胞在MSU刺激后，分泌的IL-1β水平反而更低。研究人员对此提出了一个精妙的双重作用模型来解释这一看似矛盾的现象：一方面，ENT3介导的尿酸外排有助于降低溶酶体内尿酸浓度，促进MSU溶解，从而减轻溶酶体损伤和由此引发的NLRP3炎症小体激活（抗炎作用）。另一方面，ENT3也能转运腺苷出溶酶体。已知胞质中的腺苷可通过A_2A受体增强NLRP3炎症小体的活化。因此，ENT3敲低可能导致溶酶体腺苷外排减少，胞内腺苷水平下降，进而削弱了腺苷依赖的炎症信号增强作用（促炎作用减弱）。在ENT3敲低的THP-1细胞中，后一种效应可能占主导地位，导致净效应表现为IL-1β分泌减少。研究还提出，从溶酶体排出的尿酸可能需要通过乳腺癌耐药蛋白（BCRP/ABCG2）进一步排出细胞，这表明ENT3和BCRP可能在巨噬细胞尿酸清除中协同工作。

研究结论与意义

本研究首次鉴定出ENT3（SLC29A3）是溶酶体膜上的一种质子偶联尿酸转运蛋白，其功能是将尿酸从溶酶体腔内外排至细胞质。该发现揭示了细胞内尿酸稳态调控的一个全新机制。在巨噬细胞中，ENT3通过其尿酸转运功能，可能有助于清除吞噬的MSU结晶，限制溶酶体损伤和NLRP3炎症小体的过度激活。同时，其固有的腺苷转运功能又参与了腺苷依赖的炎症信号调节。因此，ENT3在调节巨噬细胞炎症反应中扮演了一个复杂的“平衡者”角色。该研究不仅扩展了ENT3的生理功能谱，将其从核苷转运蛋白拓展至尿酸代谢领域，而且为理解痛风等尿酸相关炎症性疾病的细胞机制提供了新的视角。ENT3的功能缺陷，无论是由于遗传突变还是其他原因，都可能通过破坏溶酶体尿酸清除和/或腺苷信号，从而参与相关疾病的病理过程。未来针对ENT3的深入研究，可能为开发新的治疗策略提供潜在靶点。