种子扩增技术再现多系统萎缩α-突触核蛋白聚集体的生物学和结构特性

《Nature Communications》：Seed amplification of MSA alpha-synuclein aggregates preserves the biological and structural properties of brain-derived aggregates

本研究针对α-突触核蛋白(aSyn)构象株在体外扩增过程中能否保持原始病理特性的关键科学问题，通过系统研究证实：利用种子扩增技术(SAA)从多系统萎缩(MSA)患者脑脊液扩增的aSyn纤维，在细胞模型和转基因小鼠模型中均能保持与脑源性MSA株相似的生物学活性，并通过冷冻电镜解析出与脑源性PF-IIB原丝高度相似(1.7? RMSD)的三维结构。该发现为利用SAA技术开展疾病机制研究和药物筛选提供了重要理论依据。

　　

在神经退行性疾病研究领域，帕金森病(PD)、路易体痴呆(DLB)和多系统萎缩(MSA)等突触核蛋白病的共同病理特征，是大脑中异常聚集的α-突触核蛋白(alpha-synuclein, aSyn)。这些蛋白聚集体被认为能够像朊病毒一样在大脑内传播，但不同疾病类型的aSyn聚集体具有不同的空间构象，即所谓的"构象株"。例如，MSA患者脑中aSyn主要形成胶质细胞质包涵体(GCIs)，而PD/DLB患者则形成路易体(LBs)和路易神经突(LNs)。这些结构差异是否决定疾病的特异性，以及能否在体外实验中准确复制，是领域内的关键科学问题。

近年来兴起的aSyn种子扩增技术(aSyn-SAA)为这些问题的解答带来了希望。该技术能够高效扩增患者脑脊液(CSF)中微量的病理型aSyn聚集体，并已展现出卓越的诊断价值。然而，一个悬而未决的核心问题是：通过SAA技术在体外扩增产生的aSyn纤维，是否真正保留了患者大脑中原始aSyn聚集体的生物学特性和结构特征？这个问题直接关系到SAA技术能否作为研究疾病机制和筛选治疗药物的可靠平台。

为此，德克萨斯大学麦戈文医学院的Claudio Soto教授团队在《Nature Communications》上发表了重要研究成果。他们系统比较了MSA患者脑源性aSyn聚集体与SAA扩增aSyn纤维在生物学活性和结构特征方面的相似性，为SAA技术的可靠性提供了有力证据。

研究团队采用了多种关键技术方法：利用aSyn-SAA从MSA患者脑脊液扩增aSyn纤维；通过表达aSyn(A53T)-CFP/YFP融合蛋白的生物传感器细胞模型评估聚集体的接种活性；使用表达A53T突变人aSyn的转基因小鼠模型(M83+/-)进行体内生物学特性研究；采用蛋白质酶K消化和液相色谱-质谱联用(LC-MS)分析聚集体核心结构；通过冷冻电镜(cryo-EM)解析高分辨率三维结构。

MSA脑组织和SAA扩增aSyn聚集体的表征

研究使用4例经临床和神经病理学确诊的MSA患者脑组织样本(M1-M4)及对应的脑脊液样本。免疫组化分析确认这些样本存在典型的GCIs病理特征。通过aSyn-SAA技术从脑脊液样本中成功扩增出aSyn纤维，为后续比较研究提供了材料基础。

MSA脑源性和SAA扩增aSyn纤维在aSyn"生物传感器"细胞中的传播

在Diamond实验室开发的HEK293T生物传感器细胞模型中，MSA脑组织提取物诱导产生了丝状、串状的aSyn包涵体，这与MSA aSyn株的特异性形态特征一致。重要的是，SAA扩增的aSyn纤维同样诱导形成了相同形态的包涵体，表明其保留了脑源性MSA aSyn种子的独特接种特性。

转基因小鼠接种MSA脑匀浆后发生致命性神经系统疾病

将MSA患者脑匀浆(BH)接种至M83+/-小鼠脑内后，所有处理小鼠均在111-154天内出现严重运动功能障碍，中位生存时间为129.5天。免疫组化分析显示，小鼠脑内存在广泛的pS129阳性aSyn沉积，主要分布在中脑、脑干、下丘脑和小脑区域。蛋白酶消化实验进一步证实了这些聚集体的存在。

MSA种子SAA扩增aSyn纤维在M83+/-小鼠中诱导相似的神经系统疾病

更为关键的是，接种SAA扩增aSyn纤维的小鼠表现出与脑匀浆接种组几乎相同的疾病表型，中位生存时间为126.0天，两组间无显著差异。神经病理学分析显示，SAA组小鼠的aSyn病理分布模式、包涵体形态(环状和路易体样包涵体)及细胞倾向性(主要位于神经元)均与脑匀浆组高度一致。

脑源性和SAA扩增aSyn聚集体在M83+/-小鼠中产生相同的神经病理学改变

定量分析显示，两组小鼠在不同脑区的aSyn病理负荷无显著差异。构象稳定性实验发现，两组小鼠脑中aSyn聚集体的盐酸胍(GdnHCl)解离曲线和GdnHCl₅₀值高度相似。此外，利用aSyn-SAA对小鼠脑匀浆进行检测，均显示出典型的MSA样ThT荧光曲线，证实MSA aSyn株在小鼠体内得到了忠实传播。

MSA种子SAA扩增aSyn纤维展现出与MSA脑中原丝相似的结构

生化分析表明，SAA扩增的aSyn纤维经蛋白酶K消化后产生两条主要条带，其肽段覆盖范围与MSA患者脑中发现的PF-IB和PF-IIB原丝核心区域高度对应。冷冻电镜结构解析显示，扩增纤维中的MIII类纤维核心由G36-K96残基构成，包含7个平行同向β折叠片。该结构与MSA患者脑中PF-IIB原丝的结构高度相似，与PF-IIB1和PF-IIB2的RMSD值分别为2.3?和1.7?。尽管在原丝组装方式上存在差异(脑源性为异源二聚体，SAA扩增的为同源二聚体)，但在原丝水平上的结构相似性证实了SAA技术能够复制MSA aSyn聚集体的核心构象。

这项研究通过系统的生物学和结构学比较，提供了令人信服的证据表明aSyn-SAA扩增的纤维能够保持脑源性MSA aSyn株的主要特性。这一发现不仅巩固了SAA技术在突触核蛋白病诊断中的应用价值，更重要的是为其在疾病机制研究和治疗开发中的广泛应用奠定了基础。研究揭示了即使在缺乏脑内辅助因子的纯化系统中，SAA技术仍能忠实复制病理性的aSyn构象，这为理解蛋白质错误折叠的分子机制提供了新视角。未来研究需要进一步验证该技术对PD和DLB中aSyn株的复制能力，并探索辅助因子在维持株特性中的作用，这些工作将推动整个神经退行性疾病领域的发展。