CK2激酶介导PA28γ T23位点磷酸化：头颈鳞癌进展的新机制与治疗靶点

《Nature Communications》：Phosphorylation of PA28γ by CK2 kinase facilitates HNSCC tumor formation and progression

本研究聚焦头颈鳞状细胞癌（HNSCC）中蛋白酶体通路失调的机制。研究人员发现，酪蛋白激酶2（CK2）可磷酸化蛋白酶体激活因子28γ亚基（PA28γ）的T23位点，该修饰在多种癌症中高表达且与不良预后相关。通过构建基因敲入小鼠模型，证实PA28γ-T23磷酸化缺陷可抵抗致癌物诱导的HNSCC发生，而磷酸化模拟突变则促进肿瘤进展。机制上，CK2介导的PA28γ-pT23通过增强与转录因子E4F1的结合，进而经由PA28γ-蛋白酶体途径降解E4F1，解除其对细胞周期的抑制作用，最终驱动肿瘤增殖。该研究揭示了PA28γ-pT23作为癌症早期干预潜在靶点的重要价值。

　　

在头颈部恶性肿瘤中，头颈鳞状细胞癌（HNSCC）因其高发病率和对患者生活质量的严重影响，一直是医学研究的重点和难点。尽管手术等传统治疗手段仍是标准方案，但它们往往伴随着面部功能损伤和心理负担。因此，深入探索HNSCC发生发展的分子机制，寻找有效的治疗靶点，成为当前研究的迫切需求。

蛋白酶体激活因子28γ亚基（PA28γ，也称REGγ或PSME3）是蛋白酶体激活剂PA28家族的一员，它能以不依赖于ATP和泛素的方式，激活20S蛋白酶体核心，降解多种与细胞周期、凋亡等关键生命活动相关的蛋白质，如p21^WAF1、p53、SRC-3等。既往研究表明，PA28γ在多种人类癌症中存在扩增或过表达，其高表达与患者不良预后密切相关。我们团队前期的研究也发现，PA28γ能促进HNSCC的恶性进展，但其功能调控的具体分子机制，尤其是翻译后修饰如何精细调控其促癌活性，仍是一个尚未完全阐明的“黑箱”。

蛋白质磷酸化作为最广泛存在的翻译后修饰之一，在调控肿瘤生长和治疗反应中扮演着关键角色。然而，在PA28γ上，除了一项在骨肉瘤细胞中报道的与凋亡相关的S247位点磷酸化外，在HNSCC或其他癌症中尚未有磷酸化事件的系统描述。探索可能调控PA28γ在HNSCC恶性进展中功能的磷酸化位点，成为一个至关重要且时机成熟的研究目标。

为了回答上述问题，四川大学华西口腔医院研究团队在《Nature Communications》上发表了最新研究成果。研究人员综合利用生物化学、细胞生物学、动物模型及临床样本分析等多种技术手段，首次揭示了CK2激酶介导的PA28γ T23位点磷酸化在HNSCC肿瘤形成和进展中的核心作用及其分子机制。

本研究主要采用了以下关键技术方法：利用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）鉴定PA28γ的磷酸化位点；通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建PA28γ-T23A（磷酸化缺陷）和PA28γ-T23D（磷酸化模拟）点突变敲入小鼠模型；使用4-硝基喹啉-1-氧化物（4NQO）诱导的小鼠HNSCC模型进行体内肿瘤发生研究；利用免疫共沉淀（Co-IP）、GST/His pull-down、体外激酶实验、体外蛋白酶体降解实验等验证蛋白质相互作用及功能调控；通过组织微阵列（TMA）对多种癌症（包括HNSCC、直肠癌、胰腺癌、乳腺癌等）患者样本进行免疫组织化学（IHC）染色和生存分析；采用定量蛋白质组学（TMT标记）筛选PA28γ-pT23的下游差异表达蛋白；通过细胞增殖、克隆形成、流式细胞术（细胞周期分析）和小鼠异种移植瘤模型评估细胞和肿瘤生长能力。

PA28γ-T23磷酸化在多种癌症中高表达且预示不良预后

研究人员首先在HNSCC细胞中通过LC-MS/MS分析，鉴定出PA28γ蛋白的一个新的磷酸化位点——T23。通过构建T23A（不可磷酸化）和T23D（模拟磷酸化）突变体，证实T23是HNSCC细胞中PA28γ的主要磷酸化位点。他们成功制备并验证了针对PA28γ-pT23的特异性抗体。利用HNSCC组织微阵列（TMA）以及涵盖13种癌症类型的泛癌TMA、直肠癌、胰腺癌和乳腺癌TMA，研究发现PA28γ-pT23在肿瘤组织中的表达水平显著高于癌旁正常组织，并且其高表达与晚期美国癌症联合委员会（AJCC）分期和患者的不良总生存期显著相关。这些结果表明，PA28γ-pT23可能作为一个关键的促癌信号和跨癌种的不良预后标志物。

PA28γ-T23磷酸化促进体内肿瘤的发生和进展

为了在体内验证PA28γ-pT23的功能，研究团队利用CRISPR/Cas9技术成功构建了PA28γ^T23A和PA28γ^T23D基因敲入小鼠。在正常发育条件下，这两种突变体小鼠与野生型（WT）小鼠在体型、体重上无明显差异，表明T23位点突变本身不影响小鼠的正常生长发育。然而，当使用致癌物4NQO诱导HNSCC发生时，表型出现了显著差异：PA28γ^T23A小鼠舌部出现的菜花状或隆起性病变数量更少、体积更小，体重减轻程度也更轻；而PA28γ^T23D小鼠则表现出更严重的肿瘤负荷。组织病理学分析进一步显示，PA28γ^T23A小鼠的肿瘤浸润率低于WT小鼠，而所有PA28γ^T23D小鼠均发生肿瘤浸润，且浸润比例高于WT组。这些结果强有力地证明，PA28γ-T23磷酸化在体内敏感地调控着HNSCC的起始和进展。

CK2激酶介导PA28γ T23位点的磷酸化

接下来，研究者着手寻找负责磷酸化T23位点的上游激酶。通过生物信息学预测和LC-MS/MS相互作用蛋白谱分析的交叉比对，他们将目标锁定在酪蛋白激酶2（CK2）。Co-IP实验证实了PA28γ与CK2的调节亚基CK2β之间存在相互作用，且两者主要共定位于细胞核内。序列分析显示，PA28γ的T23位点在不同物种间高度保守，且其周围氨基酸序列符合CK2底物的特征（n-4至n+7位点富含酸性氨基酸E/D）。功能实验表明，过表达CK2能上调PA28γ WT的pT23水平，但对T23A突变体无效；反之，敲低CK2则显著降低PA28γ-pT23水平。体外激酶实验直接证实CK2可以磷酸化PA28γ WT，但不能磷酸化T23A突变体。有趣的是，PA28γ-T23的磷酸化依赖于完整的CK2全酶（包含催化亚基CK2α/CK2α'和调节亚基CK2β）的活性。表皮生长因子（EGF）作为CK2的激活剂，能以时间依赖的方式诱导PA28γ-pT23水平升高，且该诱导效应依赖于CK2，特别是CK2β亚基。CK2抑制剂TBB和CX-4945能有效抑制PA28γ-T23的磷酸化。此外，研究还排除了PA28γ的已知伙伴蛋白NIP30在此过程中的干扰，表明CK2与PA28γ的相互作用及其介导的T23磷酸化是独立于NIP30的。

PA28γ-T23磷酸化通过降低E4F1蛋白水平缓解其转录效应

为了阐明PA28γ-T23磷酸化调控肿瘤恶性表型的下游机制，研究人员对PA28γ WT和T23A救援细胞进行了定量蛋白质组学分析，筛选出39个潜在差异表达蛋白。结合TCGA数据库分析提示E4F1（E4F转录因子1）与HNSCC患者生存相关，且是细胞周期的重要调控因子，因此被选为重点研究对象。在4NQO诱导的小鼠模型舌组织中，多色IHC染色显示，与WT小鼠相比，PA28γ^T23A小鼠的E4F1蛋白水平升高，而PA28γ^T23D小鼠的E4F1水平降低。在细胞模型中，与PA28γ WT相比，T23A突变增加了E4F1的蛋白水平并延长了其半衰期，而T23D突变则降低了E4F1水平并缩短了其半衰期，但对E4F1的mRNA水平没有影响。已知E4F1是细胞周期蛋白Cyclin A2的转录抑制因子，本研究也验证了E4F1能负调控Cyclin A2的表达。相应地，T23A突变降低了Cyclin A2蛋白水平，而T23D突变则增加了Cyclin A2水平，这与E4F1的变化趋势相反。此外，CK2的过表达或EGF刺激能降低WT细胞中E4F1水平，但在T23A救援细胞中无此效应；CK2抑制剂则能增加E4F1水平。E4F1的多个靶基因（如DLAT、DNAJC19等）的mRNA水平也受到PA28γ-pT23的调控。这些结果表明，PA28γ-T23磷酸化通过降低E4F1蛋白丰度，缓解了E4F1介导的转录抑制效应。

CK2介导的PA28γ-T23磷酸化促进PA28γ与E4F1的相互作用

鉴于PA28γ-pT23影响E4F1的稳定性，研究者进一步探究了二者是否存在直接相互作用。免疫荧光显示PA28γ和E4F1在细胞核内共定位。Co-IP实验证实了内源性和外源性PA28γ与E4F1蛋白之间存在相互作用。通过构建E4F1截断体，发现PA28γ特异性结合E4F1的aa357-784区域，而非其DNA结合域（aa1-357）。重要的是，T23A突变减弱了PA28γ与E4F1的结合，而T23D突变则增强了它们的相互作用。CK2的过表达能增强E4F1与PA28γ WT的结合，但对T23突变体无效。EGF刺激能加强PA28γ与E4F1的结合，而CK2抑制剂TBB或CX-4945则削弱这种结合。这些数据表明，CK2介导的PA28γ-T23磷酸化增强了PA28γ与E4F1的蛋白相互作用。

PA28γ通过PA28γ-蛋白酶体途径促进E4F1降解

PA28γ作为蛋白酶体激活剂，其最直接的功能是促进蛋白质降解。研究人员发现，过表达PA28γ能以剂量依赖的方式降低E4F1蛋白水平，但不影响其mRNA表达，并显著缩短E4F1蛋白的半衰期。蛋白酶体抑制剂MG132可以阻断PA28γ对E4F1的下调作用。关键的是，只有具有蛋白酶体激活活性的PA28γ WT和T23D能有效降低E4F1水平，而蛋白酶体激活功能缺失的突变体N151Y和K195R，以及T23A突变体，则丧失了此功能。体外蛋白酶体降解实验最终证实，E4F1能够被PA28γ-20S蛋白酶体以不依赖于 ubiquitin 和 ATP 的方式降解，且该降解过程可被蛋白酶体抑制剂epoxomicin所抑制。与WT相比，T23A突变体对E4F1的体外降解能力大大减弱。这些结果清晰地表明，CK2介导的PA28γ-pT23通过增强其与E4F1的结合，进而通过PA28γ-蛋白酶体途径促进E4F1的降解。

PA28γ-T23磷酸化通过E4F1促进HNSCC细胞增殖和肿瘤生长

功能实验表明，敲低E4F1可以挽救由PA28γ敲低导致的HNSCC细胞增殖、克隆形成能力下降以及小鼠体内肿瘤生长抑制，提示E4F1是PA28γ调控癌细胞生长的关键下游效应因子。相应地，T23A突变或过表达E4F1能抑制HNSCC细胞和肿瘤的生长，而T23D突变或敲低E4F1则促进生长。敲低E4F1可以挽救T23A突变引起的细胞增殖能力下降。细胞周期分析显示，E4F1过表达引起G0/G1期阻滞，从而抑制细胞生长；与WT相比，T23A救援癌细胞表现出G0/G1期阻滞，而敲低E4F1则通过解除G0/G1期阻滞，增加S期细胞比例，从而促进增殖。此外，敲低CK2能抑制PA28γ WT细胞的克隆形成，但对T23D救援细胞无效，说明CK2缺失可通过降低PA28γ-pT23来抑制癌细胞生长。这些发现证明了CK2-PA28γ-pT23-E4F1轴在体外和体内均能促进HNSCC生长。

CK2介导的PA28γ-T23磷酸化轴促进HNSCC进展

对HNSCC组织微阵列的分析显示，E4F1的表达与PA28γ-pT23呈负相关，在癌旁正常组织中高表达，在晚期AJCC分期中表达降低，且低E4F1表达预示患者不良预后。在HNSCC进展过程中（从正常组织、癌前病变、原发肿瘤到转移淋巴结），CK2β、PA28γ-pT23和Cyclin A2的水平呈现渐进性升高，而E4F1表达则呈下降趋势。在有淋巴结转移的HNSCC病例中，CK2β、PA28γ-pT23和Cyclin A2水平显著高于无淋巴结转移者，而E4F1水平则降低。这些临床数据为CK2-PA28γ-pT23轴促进HNSCC进展提供了直接的来自患者的证据。

本研究首次系统地揭示了PA28γ-T23位点磷酸化在癌症中的广泛存在及其重要的临床预后意义。通过精巧的基因工程小鼠模型，证实了该磷酸化修饰在HNSCC发生发展中的因果作用。在分子机制上，阐明了从上游激酶CK2接收信号，到增强与下游底物E4F1的相互作用，进而通过独特的PA28γ-蛋白酶体通路降解E4F1，最终驱动细胞周期进程和肿瘤生长的完整通路（CK2-PA28γ-T23-E4F1）。该研究不仅深化了对蛋白酶体功能调控的理解，也为HNSCC乃至其他癌症的早期干预和靶向治疗提供了新的潜在靶点（PA28γ-pT23）。未来，在大型纵向临床队列中验证该轴是否可作为恶性转化和/或淋巴结转移的风险因素，将为潜在的临床转化奠定基础。同时，E4F1蛋白本身含有大量柔性区域，其被PA28γ特异性降解的结构机制，以及PA28γ-pT23是否还通过E4F1调控其他靶点，将是值得进一步探索的方向。总之，靶向CK2介导的PA28γ-pT23轴，有望成为治疗HNSCC等癌症的一种有前景的策略。