T细胞识别SARS-CoV-2核衣壳蛋白两个免疫优势表位的克隆限制性与多样性结构解析

《Nature Communications》：Structural insights into clonal restriction and diversity in T cell recognition of two immunodominant SARS-CoV-2 nucleocapsid epitopes

本研究针对SARS-CoV-2核衣壳（N）蛋白中两个免疫优势T细胞表位（HLA-A02:01限制性LLL和HLA-B07:02限制性SPR）的识别机制，通过解析T细胞受体（TCR）与pMHC复合物的晶体结构，揭示了T细胞应答克隆限制性（LLL特异性TCRs）和多样性（SPR特异性TCRs）的结构基础，为理解冠状病毒T细胞免疫应答、疫苗设计及计算建模提供了重要框架。

　　

在COVID-19大流行的背景下，适应性免疫应答，特别是T细胞免疫，在控制SARS-CoV-2感染和建立长期保护中扮演着关键角色。与主要针对高度变异的刺突（S）蛋白的中和抗体不同，T细胞能够靶向病毒内部更为保守的蛋白质，例如核衣壳（N）蛋白，这为应对不断出现的病毒变异株提供了更持久的免疫保护希望。在SARS-CoV-2的N蛋白中，有两个免疫优势CD8⁺T细胞表位备受关注：一个是由HLA-A02:01分子呈递的N_222-230表位（LLLDRLNQL，简称LLL），另一个是由HLA-B07:02分子呈递的N_105-113表位（SPRWYFYYL，简称SPR）。然而，针对这两个表位的T细胞应答呈现出截然不同的特征：针对LLL的T细胞受体（TCR）库表现出显著的克隆限制性，超过50%的TCR使用高度相似的TRAV12-1或TRAV12-2基因片段；而针对SPR的TCR库则显示出极高的多样性， utilizing 多种不同的α/β链组合。这种差异背后的结构机制是什么？它又如何影响T细胞对病毒变异株的识别和潜在的免疫逃逸？这些问题对于理解抗病毒免疫和指导下一代疫苗设计至关重要。为了解答这些问题，由Ping Yuan、Guodong Chen、Yukun Li等研究人员领导的研究团队在《Nature Communications》上发表了他们的研究成果。

研究人员综合运用了结构生物学、生物物理和计算生物学等方法。关键实验技术包括：蛋白质结晶与X射线晶体学（解析了TCR-LLL-HLA-A2和TCR-SPR-HLA-B7复合物结构）、表面等离子共振（SPR）技术（测定TCR与pMHC的结合亲和力）、计算突变扫描（使用Rosetta软件预测表位变异对结合的影响）、以及深度学习结构预测（使用AlphaFold2/TCRmodel2和AlphaFold3对TCR-pMHC复合物进行建模）。研究所用的TCRs分离自COVID-19康复期患者（CPs）的外周血细胞。病毒序列变异频率数据来自GISAID数据库。

Interaction of SARS-CoV-2-specific TCRs with nucleocapsid epitopes SPR and LLL

研究人员首先分离并表征了特异性识别SPR-HLA-B7的TCRs（Q04和CLB）以及识别LLL-HLA-A2的TCR（LLL6）。通过表面等离子共振（SPR）分析，测得TCR Q04和CLB与SPR-HLA-B7结合的解离常数（K_D）分别为0.43 μM和0.41 μM，表明具有高亲和力。TCR LLL6与LLL-HLA-A2结合的K_D为3.6 μM。研究人员还构建了一个LLL6的变体LLL6E（将其Vα区从TRAV12-2替换为TRAV12-1），其结合亲和力（K_D= 15.2 μM）与野生型LLL6相比仅有适度下降，提示TRAV12-1和TRAV12-2在功能上可能具有互换性。

Overview of the TCR-SPR-HLA-B7 and TCR-LLL-HLA-A2 complexes

为了在原子水平上理解识别机制，研究团队成功解析了Q04-SPR-HLA-B7、CLB-SPR-HLA-B7和LLL6E-LLL-HLA-A2三个复合物的晶体结构，分辨率分别为2.75 ?、2.04 ?和2.17 ?。结构分析表明，尽管Q04和CLB都以典型的对角线方向结合在SPR-HLA-B7上，但它们的交叉角（52° 对比 44°）和入射角（20° 对比 10°）不同，反映了不同的结合模式。与之相反，LLL6E-LLL-HLA-A2与此前报道的LLL8-LLL-HLA-A2复合物具有非常相似的结合角度（交叉角33° 对比 31°），尽管它们使用了不同的Vβ链。

Interaction of TCRs Q04 and CLB with HLA-B7

对TCR与MHC相互作用的深入分析揭示，TCR Q04与HLA-B7之间有大量的直接接触（87个原子接触），其中CDR3α环贡献了超过一半的相互作用。而TCR CLB与HLA-B7的直接接触很少（仅27个），但复合物结构中存在大量水分子介导的氢键，显著改善了界面形状互补性（Sc值从0.75提升至0.83），这在一定程度上补偿了直接接触的不足，并解释了为何两者亲和力相近。

Interaction of TCR LLL6E with HLA-A2

在LLL6E-LLL-HLA-A2复合物中，TCR与MHC的相互作用主要由Vα域主导（占54个总接触中的67%），特别是胚系编码的CDR1α环贡献最大。尽管LLL6E（使用TRAV12-1）和LLL8（使用TRAV12-2）的CDR1α和CDR2环序列存在不同，但其中与MHC相互作用的关键残基（如CDR1α Gln31, CDR2α Tyr51）是保守的，并在两个复合物中与HLA-A2形成相似的相互作用网络。这解释了为何TRAV12-1和TRAV12-2可以互换，并支持TCR与MHC共进化的假说。

SPR epitope recognition by TCRs Q04 and CLB

在表位识别方面，TCR Q04和CLB都主要聚焦于SPR肽段的中央部分，特别是P4色氨酸（Trp），该残基深深插入由TCR CDR环形成的口袋中。计算丙氨酸扫描预测P4 Trp对结合能贡献最大，实验也证实将其突变为丙氨酸会完全消除TCR结合。此外，CLB还通过多个水介导的氢键与P6苯丙氨酸（Phe）相互作用。这种结合模式的差异体现了不同TCR克隆识别同一表位的“多重结构解决方案”。

LLL epitope recognition by TCR LLL6E

TCR LLL6E与LLL肽段的相互作用覆盖了其整个长度。Vα域（尤其是CDR1α和CDR2α）负责识别N端半部分（如与P2 Leu, P4 Asp, P5 Arg形成密集氢键网络），而Vβ域的CDR3β环则主导与C端半部分（P6 Leu和P8 Gln）的结合，其中包含多个水桥。这种Vα主导、Vβ辅助的模式使得LLL特异性TCR能够与多种不同的Vβ链配对，但Vα链的使用却高度受限。研究还通过计算和实验验证，非优势基因TRAV12-3所编码的CDR1α Tyr32会破坏与LLL肽段的相互作用，这从结构上解释了为何在患者中未观察到TRAV12-3的使用。

Cross-recognition of SPR and LLL variants and homologous epitopes

利用已解析的结构作为框架，研究人员通过计算建模和实验验证，评估了TCRs对SARS-CoV-2变异株和其他人类冠状病毒同源表位的交叉识别能力。对于SPR表位，其自然变异在GISAID数据库中频率极低（<0.005%）。预测和实验均表明，常见的P1 Ser→Leu变异（存在于OC43和HKU1冠状病毒中）不影响Q04和CLB的结合，甚至略微增强了亲和力，这支持了SARS-CoV-2特异性T细胞可能交叉识别这些普通感冒冠状病毒的观察。而对于LLL表位，其变异频率显著更高，其中最突出的的是P8 Gln→Lys（Q229K）突变，频率达3.34%。计算预测和表面等离子共振实验均表明，Q229K突变会破坏LLL6E和LLL8的结合。该突变存在于Omicron BA.2.86/JN.1谱系中，并被证实可导致T细胞免疫逃逸，其较高的流行频率可能反映了病毒在克隆限制性T细胞应答压力下的选择优势。

Conformational changes in pMHC upon TCR binding

通过比较结合与未结合的pMHC结构，研究人员观察到TCR结合诱导了肽段构象变化。在SPR-HLA-B7中，P4 Trp的侧链发生显著旋转以容纳TCR。在LLL-HLA-A2中，P5 Arg的侧链移动了高达7.2 ?，以便与TCR LLL6E的CDR1α形成氢键。

Modeling Q04, CLB, and LLL6E TCR-pMHC complexes with AlphaFold

研究还评估了深度学习工具AlphaFold（包括基于AlphaFold2的TCRmodel2和AlphaFold3）对这三个新型TCR-pMHC复合物的预测能力。结果显示，预测准确性因复合物而异：对于Q04-SPR-HLA-B7和LLL6E-LLL-HLA-A2复合物，两种方法都生成了高精度的模型（界面RMSD <1 ?）；然而，对于CLB-SPR-HLA-B7复合物，即使排名最高的模型也不准确，尽管其置信度评分较高。这表明AlphaFold在TCR-pMHC建模方面具有潜力，但在模型评分和一致性生成高精度模型方面仍需改进。

本研究通过解析TCR识别SARS-CoV-2核衣壳蛋白两个关键免疫优势表位的三维结构，深刻揭示了T细胞应答克隆限制性（LLL特异性TCRs）和多样性（SPR特异性TCRs）的分子基础。研究结果表明，SPR表位引发的多样化TCR库可能通过提供“多重结构解决方案”来有效应对潜在的病毒逃逸突变，这或许是该表位在自然流行中变异频率极低的原因之一。相反，LLL表位所受到的克隆限制性T细胞应答，则可能使病毒更容易通过单个关键点突变（如Q229K）实现免疫逃逸，这与该突变在病毒种群中相对较高的流行频率相符。这些结构见解不仅增进了我们对冠状病毒T细胞免疫的认识，也为设计针对保守表位的下一代广谱疫苗提供了理论依据和结构框架。此外，对AlphaFold建模能力的评估既展示了其在某些情况下的成功应用，也指出了当前计算方法的局限性，为未来开发更精准的免疫识别预测工具指明了方向。这项研究将结构生物学与免疫学、病毒学紧密结合，为理解宿主与病原体相互作用的复杂性和设计有效的免疫干预策略做出了重要贡献。