IGF2BP3通过直接调控突变型FMR1 mRNA的非AUG翻译促进脆性X前突变相关疾病中毒性蛋白FMRpolyG的合成

《Nature Communications》：IGF2BPs directly regulate the noncanonical translation of toxic proteins from mutant FMR1 mRNA containing expanded CGG repeats

脆性X前突变相关疾病(FXPACs)的发病机制与FMR1基因5'UTR中CGG重复序列扩展(rCGGexp)触发的非AUG翻译(RAN翻译)产生的毒性FMRpolyG蛋白密切相关。本研究通过RNA-蛋白质pull-down结合蛋白质组学分析，发现胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白3(IGF2BP3)可直接结合FMR1 mRNA的5'UTR区域，特异性正向调控FMRpolyG的RAN翻译过程。研究人员证实IGF2BP3的敲低可显著降低FMRpolyG的生物合成和细胞毒性，而在FXPAC线虫模型中破坏IGF2BP同源基因imph-1可改善疾病表型。该研究揭示了IGF2BP3作为FXPAC潜在治疗靶点的重要价值。

　　

在人类基因组中，短串联重复序列是一种常见的遗传特征，但当这些重复序列过度扩展时，就可能引发一系列严重的遗传性疾病。脆性X信使核糖核蛋白1基因(FMR1)5'非翻译区(5'UTR)中的CGG重复序列扩展，正是导致脆性X前突变相关疾病(FXPACs)的关键因素。这类疾病包括脆性X相关震颤/共济失调综合征(FXTAS)、脆性X相关原发性卵巢功能不全(FXPOI)和脆性X相关神经精神障碍(FXAND)等，目前尚无有效治疗方法。

在分子水平上，FMR1基因的前突变(55-200个CGG重复)会导致一种特殊的翻译机制——重复相关非AUG翻译(RAN翻译)。这种非常规的翻译过程绕过了传统的AUG起始密码子，利用近同义起始密码子(如ACG或GUG)启动翻译，产生含有长聚甘氨酸链的毒性蛋白FMRpolyG。这种异常蛋白被认为在FXPAC的发病机制中扮演着关键角色，在患者脑组织和外周器官中形成的FMRpolyG阳性包涵体是FXTAS的病理标志。

尽管科学界对CGG RAN翻译的认识不断深入，但调控这一过程的关键分子机制仍不清楚。波兰亚当·密茨凯维奇大学分子生物学与生物技术研究所的Anna Baud、Krzysztof Sobczak及其合作团队在《Nature Communications》上发表的研究，首次揭示了胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白(IGF2BPs)家族在调控FMRpolyG生物合成中的核心作用。

为开展此项研究，研究人员主要采用了以下几种关键技术方法：通过RNA-蛋白质pull-down结合质谱分析筛选与FMR1 mRNA 5'UTR相互作用的蛋白质；利用凝胶迁移实验(EMSA)和滤膜结合实验验证蛋白质与RNA的直接相互作用；通过细胞模型中的基因敲低和过表达实验验证靶蛋白功能；使用患者来源的诱导多能干细胞(iPSC)分化的神经元进行疾病建模；并建立了新型脆性X前突变相关疾病线虫模型进行体内验证。研究中使用的FXTAS患者来源的iPSC细胞系由合作者提供。

RNA-蛋白质pull-down鉴定与FMR1 mRNA 5'UTR结合的潜在相互作用蛋白

研究人员首先设计了一套生物素标记的RNA探针，包括含有约100个CGG重复的FMR1 5'UTR(FMR1-99CGG)、不含CGG重复的FMR1 5'UTR(FMR1-delCGGs)、GC含量相当的对照RNA(GC-rich)以及仅含23个CGG重复的RNA。通过将这些RNA探针与人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞蛋白提取物共孵育，然后进行链霉亲和素纯化和质谱分析，鉴定出约25种在FMR1-99CGG RNA上显著富集的蛋白质。其中，IGF2BP3蛋白因其在RNA运输、翻译调控和稳定性方面的已知功能而引起了研究人员的特别关注。

后续的体外实验验证表明，重组IGF2BP3能以高亲和力(解离常数K_d= 3.15 ± 0.79 nM)与含有CGG重复的FMR1 5'UTR RNA直接结合，且这种结合不依赖于CGG重复的存在。对公开增强紫外交联免疫沉淀(eCLIP)数据的分析进一步证实，IGF2BP3在细胞中确实能与FMR1 5'UTR区域结合。

IGF2BP3正向调控扩展CGG重复细胞中RAN翻译的FMRpolyG水平

为了探究IGF2BP3是否调控FMRpolyG的RAN翻译，研究人员在人胚胎肾细胞(HEK-293T)、人宫颈癌细胞(HeLa)和人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)中敲低IGF2BP3表达。结果表明，在所有测试的细胞模型中，IGF2BP3敲低均导致含有长聚甘氨酸链的FMRpolyG(FMR99xG)蛋白水平显著降低约2倍。重要的是，IGF2BP3敲低并不影响由同一mRNA不同阅读框编码的内源性FMRP水平，表明其调控具有特异性。

相反，当研究人员过表达IGF2BP3时，观察到了相反的效果：FMRpolyG蛋白水平显著增加。进一步的研究发现，IGF2BP3敲低不仅能减少可溶性和聚集形式的FMRpolyG，还能显著降低由毒性FMRpolyG诱导的细胞凋亡。

IGF2BP3依赖性调控对FMRpolyG的RAN翻译具有特异性并依赖于FMR1 RNA序列背景

研究人员发现，当将FMRpolyG的起始密码子从近同义ACG密码子替换为经典AUG密码子时，IGF2BP3敲低不再影响FMRpolyG的水平，表明IGF2BP3的调控作用特异于非AUG起始的RAN翻译。体外翻译实验直接证明，添加重组IGF2BP3能显著增强FMRpolyG的生物合成。

通过生物信息学分析，研究人员发现FMR1 5'UTR中含有多个CA基序和GGC核心元件，这些是IGF2BP3识别结合的关键序列。突变其中一个位于CGG重复上游的CA基序后，IGF2BP3对FMRpolyG的调控作用完全消失，证明这一特定序列对IGF2BP3的功能至关重要。

其他IGF2BP旁系同源物调控RAN翻译的FMRpolyG生物合成

IGF2BP家族包括三个成员：IGF2BP1、IGF2BP2和IGF2BP3，它们具有高度的序列同源性和相似的结构域组成。研究发现，敲低IGF2BP1或IGF2BP2同样能降低FMRpolyG水平，而过表达这些蛋白则能增强FMRpolyG的产生。与IGF2BP3类似，IGF2BP1和IGF2BP2的敲低也不影响由AUG起始的FMRpolyG翻译。这些结果表明，IGF2BP家族成员可能共同调控FMRpolyG的RAN翻译过程。

靶向IGF2BP3的小分子抑制剂调节FMRpolyG水平

研究人员测试了三种已知能下调IGF2BP3表达的小分子化合物：JQ1、I-BET151和异紫堇定。结果显示，这三种化合物均能有效降低IGF2BP3和毒性FMR99xG蛋白水平，但对含有短聚甘氨酸链的FMR16xG无影响。值得注意的是，JQ1和I-BET151处理还能降低FXTAS患者来源iPSC分化神经元的凋亡率，展示了这些化合物的治疗潜力。

IGF2BP3调控FXTAS患者来源细胞中FMR1 mRNA水平

在FXTAS患者来源的成纤维细胞和iPSC分化的神经元中敲低IGF2BP3，发现FMR1 mRNA水平显著上升，这与过表达模型中的观察一致。更重要的是，降低IGF2BP3表达能挽救FXTAS iPSC分化神经元的坏死表型，进一步支持了IGF2BP3在FXPAC病理机制中的重要作用。

imph-1/IGF2BP破坏在线虫中挽救99xCGG表型

研究人员构建了表达人FMR1 5'UTR片段(含99个CGG重复)的转基因线虫模型(99xCGG)。这些线虫表现出严重的表型缺陷，包括后代数量减少、运动能力受损和寿命缩短。当在这种99xCGG线虫中破坏IGF2BP直系同源基因imph-1时，FMRpolyG-GFP荧光强度降低，FMR1-99CGG mRNA水平上升，且线虫的疾病表型得到显著改善，证明了IGF2BP在动物模型中调控CGG重复毒性的保守功能。

本研究系统揭示了IGF2BP3及其家族成员通过直接结合FMR1 mRNA 5'UTR特异性调控毒性蛋白FMRpolyG生物合成的新机制。研究人员提出的工作模型认为，IGF2BP3结合至CGG重复上游的CA基序和GGC序列后，可能对43S预起始复合物(PIC)的扫描造成空间阻碍，从而增加在近同义起始密码子的非经典翻译起始效率。当IGF2BP3被抑制时，PIC扫描更为顺畅，毒性FMRpolyG的产生减少。

这一发现不仅深化了我们对RAN翻译分子机制的理解，更重要的是为FXPAC的治疗提供了新的靶点策略。研究表明，靶向IGF2BPs的小分子抑制剂能有效降低毒性FMRpolyG水平，改善疾病相关表型，展现出良好的转化医学前景。同时，研究中所建立的99xCGG线虫模型也为进一步研究FXPAC的分子机制和筛选治疗药物提供了有价值的实验平台。