HRD1介导的泛素化：TLR3胞内运输与天然免疫信号传导的关键调控机制

《Nature Communications》：Ubiquitination by HRD1 is essential for TLR3 trafficking and its innate immune signaling

本研究揭示了内质网E3泛素连接酶HRD1通过催化TLR3第813位赖氨酸(K813)发生K48/K63型泛素化修饰，进而促进TLR3被ESCRT复合物识别并转运至内溶酶体进行切割活化，该非经典功能独立于HRD1的ERAD活性，为天然免疫受体的运输调控提供了新机制。

　　

当病毒入侵机体时，免疫系统会通过模式识别受体（PRRs）快速识别病原体相关分子模式（PAMPs），启动天然免疫应答。Toll样受体3（TLR3）作为识别双链RNA（dsRNA）的重要受体，在抗病毒免疫中扮演着关键角色。TLR3在內质网（ER）合成后，需要被精确地运输到内溶酶体中进行蛋白水解切割才能被激活，从而避免识别自身核酸。然而，调控TLR3从内质网到内溶酶体这一精确运输过程的分子机制尚不完全清楚。同时，内质网作为蛋白质合成、折叠和质量控制的核心细胞器，其内的相关因子如何调控TLR3的翻译后修饰和运输，是一个亟待回答的科学问题。

为了回答上述问题，浙江大学的梁廷波教授团队与重庆医科大学的季晔伟教授、罗源教授等合作，在《Nature Communications》上发表了题为“Ubiquitination by HRD1 is essential for TLR3 trafficking and its innate immune signaling”的研究论文。该研究发现了内质网驻留的E3泛素连接酶HRD1（HMG-CoA reductase degradation protein 1）是调控TLR3运输和信号传导的关键因子。HRD1并非通过其经典的内质网相关降解（ERAD）功能降解TLR3，而是通过泛素化TLR3，促进其被ESCRT（内体分选复合物）机器识别，从而正向调控TLR3向內溶酶体的运输、切割及其下游的天然免疫信号传导。这一发现揭示了HRD1在天然免疫中的非经典功能，将蛋白质的泛素化修饰与免疫传感器的胞内运输直接联系起来。

本研究综合运用了多种关键技术方法。研究人员利用CRISPR/Cas9技术构建了Hrd1基因敲除（KO）的巨噬细胞系（如RAW 264.7）和胚胎成纤维细胞（MEF），并通过小干扰RNA（siRNA）在原代巨噬细胞中进行基因敲低。他们采用了免疫共沉淀联合质谱分析（CoIP-MS）来筛选HRD1的相互作用蛋白，并通过免疫共沉淀（CoIP）和体外泛素化实验验证了HRD1对TLR3的泛素化修饰。此外，研究还利用激光共聚焦显微镜观察TLR3在不同细胞器（如内质网、高尔基体、内溶酶体）中的定位，并通过细胞器分离技术进行验证。为了探究体内功能，研究团队使用了HRD1的特异性小分子抑制剂LS-102，并利用CRISPR/Cas9技术构建了TLR3 K813R点突变敲入（KI）小鼠模型，进而通过酶联免疫吸附试验（ELISA）、实时定量PCR（qPCR）、蛋白质免疫印迹（Western blot）以及组织病理学分析等方法，在细胞和小鼠水平评估了HRD1-TLR3轴在免疫应答中的功能。

研究结果

HRD1与TLR3相互作用并在TLR3刺激后增强

研究人员通过免疫共沉淀-质谱联用（CoIP-MS）技术，在野生型（WT）和Hrd1^-/-巨噬细胞中筛选HRD1的内源性相互作用蛋白，发现TLR3是HRD1的特异性结合蛋白之一。后续实验证实，HRD1与TLR3在基础状态下存在相互作用，并且在用dsRNA类似物聚肌胞苷酸（poly(I:C)）刺激后，两者的相互作用以及HRD1的蛋白水平均显著增强。结构域映射分析表明，HRD1的跨膜（TM）结构域和胞质区的RING结构域，以及TLR3的跨膜结构域，对于两者的有效相互作用至关重要。

HRD1正向调控TLR3介导的免疫信号

在Hrd1缺陷的巨噬细胞、人胚胎肾293T（HEK293T）细胞以及原代巨噬细胞中，poly(I:C)刺激诱导的TBK1、IRF3、p65和IκBα的磷酸化水平均显著降低。Hrd1缺陷或使用HRD1抑制剂LS-102处理，均导致炎症细胞因子（如TNFα, IL6, IFNB）的转录和分泌水平下降。此外，来自Hrd1^-/-巨噬细胞的条件培养基对单纯疱疹病毒1型（HSV-1）复制的抑制能力减弱。这些结果表明HRD1对TLR3信号通路起正向调控作用。

HRD1和TLR3信号形成正反馈环路

研究发现，TLR3信号通路的激活通过ERK1/2-ETS1轴向上调控HRD1的表达。反过来，HRD1的活性通过STAT1依赖性方式，促进了TLR3及其转录调控因子IRF1/IRF2的转录上调，从而放大了炎症反应，形成了一个正反馈环路。

HRD1对TLR3信号的影响与ERAD和未折叠蛋白反应（UPR）解耦

与HRD1介导降解其他底物的经典ERAD功能不同，HRD1的缺失并不影响TLR3全长蛋白的丰度和稳定性。使用VCP抑制剂Eeyarestatin I抑制ERAD整体活性，或使用衣霉素（Tg）诱导ER应激，均不能模拟或逆转Hrd1缺陷导致的TLR3信号减弱。同样，抑制IRE1α-XBP1s这一UPR分支也不能挽救Hrd1缺陷细胞中TLR3信号的减弱。这些证据表明HRD1对TLR3的调控独立于其ERAD功能和ER应激。

HRD1通过泛素化TLR3调控其信号

研究人员证实HRD1能够在体内外直接催化TLR3发生泛素化，且此修饰在poly(I:C)刺激后增强。HRD1的RING结构域（E3连接酶活性域）和跨膜结构域对其催化TLR3泛素化至关重要。HRD1主要催化形成K48和K63连接的多聚泛素链。值得注意的是，被HRD1泛素化的TLR3不与VCP结合，反而减少了HRD1与VCP的相互作用，这可能是TLR3避免被蛋白酶体降解的关键。此外，TLR3不与ERAD适配蛋白SEL1L、BIP或OS9相互作用，且SEL1L的缺失并不影响HRD1对TLR3的泛素化及其信号调控，进一步支持了HRD1对TLR3的调控独立于经典的SEL1L-HRD1 ERAD复合物。

HRD1促进TLR3向内溶酶体运输以便其切割

共聚焦显微镜和细胞器分离实验显示，在Hrd1缺陷细胞中，TLR3能够正常从内质网运输到高尔基体，但其向早期内体（Rab5阳性）和晚期内体/溶酶体（Rab7/LAMP1阳性）的运输严重受损。相应地，poly(I:C)刺激后，Hrd1缺陷细胞中TLR3的切割形式显著减少。糖基化分析（Endo H/PNGase F）表明，位于内质网后区室（Endo H抗性）的非切割TLR3以及最终的切割TLR3在Hrd1缺陷细胞中均减少。机制上，HRD1介导的TLR3泛素化增强了其与ESCRT机器关键组分（HRS, TSG101, VPS36）的结合，从而促进其向内溶酶体的分选。

HRD1在K813位点泛素化TLR3对其运输至关重要

通过点突变扫描，研究人员将HRD1对TLR3的主要泛素化位点定位于胞内区的K813位点。TLR3 K813R突变体不仅泛素化水平大幅降低，其向内溶酶体的运输和蛋白切割过程也受阻，并且TLR3下游信号传导能力显著减弱。

HRD1在体内促进TLR3介导的炎症反应

在动物模型中，给予小鼠HRD1抑制剂LS-102可显著减轻poly(I:C)攻击引起的全身性炎症反应、组织损伤和死亡率。更重要的是，研究人员成功构建了TLR3 K813R点突变敲入（KI）小鼠。该小鼠的骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）对poly(I:C)的反应性降低，且小鼠在poly(I:C)攻击下，血清炎症因子水平、组织炎症损伤和死亡率均显著低于野生型对照小鼠。这从体内水平证实了HRD1介导的TLR3 K813泛素化具有重要的生理病理意义。

结论与意义

该研究揭示了一个之前未被认识的调控TLR3信号传导的机制：内质网E3连接酶HRD1通过催化TLR3发生K813位点的泛素化（主要为K48和K63连接），从而促进TLR3被ESCRT复合物识别并分选至内溶酶体进行切割活化。这一功能完全独立于HRD1经典的ERAD降解活性以及ER应激信号，体现了HRD1的一种“兼职”功能（moonlighting function）。这项研究将蛋白质的泛素化修饰与天然免疫受体的精确胞内运输直接联系起来，深化了对天然免疫调控网络的理解。鉴于TLR3和STING（也是HRD1的底物，但被降解）激动剂作为疫苗佐剂的研发前景，该研究提示针对HRD1的干预策略需要考虑到其对不同天然免疫通路的差异化调控，为相关药物研发提供了新的视角和潜在的靶点。