钙离子依赖的C1ql1/BAI3复合物组装在突触连接中的结构基础及其功能意义

《Nature Communications》：Structural basis of calcium-dependent C1ql1/BAI3 assemblies in synaptic connectivity

突触连接是大脑功能的基础。本研究聚焦于CF-PC（攀爬纤维-浦肯野细胞）突触形成的关键分子机制，解析了分泌蛋白C1ql1通过其gC1q（球状C1q）结构域发生钙离子（Ca2+）调控的域交换形成六聚体，并与突触后受体BAI3（脑特异性血管生成抑制因子3）的eCUB（扩展CUB）结构域以Ca2+依赖的方式结合。研究结合冷冻电镜（cryo-EM）、分子动力学（MD）模拟及体内外功能实验，揭示了C1ql1通过N端（NT）和gC1q介导的寡聚化形成线性簇状结构，从而有效富集BAI3受体、维持突触连接的分子模型，为理解分泌因子介导的突触组装提供了新机制。

　　

大脑如同一个极其精密的网络，其中数以百亿计的神经元通过名为“突触”的特殊连接点进行通信。突触的精确形成与稳定维持是大脑正常功能的基础，而这一过程依赖于突触前和突触后细胞膜上大量细胞粘附分子（CAMs）的相互作用。近年来，科学家们发现，除了这些锚定在膜上的分子，突触间隙中还存在一些神秘的“信使”——分泌蛋白，它们像桥梁一样连接着突触两侧，对突触的组装至关重要。C1q样蛋白（C1qls）家族便是其中一类关键分子，尤其在攀爬纤维（CF）与浦肯野细胞（PC）这一重要的兴奋性突触连接中，C1ql1及其伙伴——一种名为脑特异性血管生成抑制因子3（BAI3，亦称为ADGRB3）的粘附G蛋白偶联受体（aGPCR），扮演着核心角色。然而，C1ql1如何与BAI3精确结合，以及这种结合如何动态调控以响应突触微环境的变化，其分子细节一直笼罩在迷雾之中。

为了揭开这一谜团，来自南方科技大学、北京大学深圳研究生院和深圳湾实验室等多个研究团队的合作研究在《Nature Communications》上发表了他们的最新成果。研究人员综合运用生物化学、结构生物学、计算生物学以及细胞和动物模型等多种技术手段，首次清晰地揭示了C1ql1与BAI3相互作用的精细结构基础，并发现了一个意想不到的、受钙离子（Ca²⁺）调控的C1ql1自组装新机制，从而深化了我们对突触连接分子密码的理解。

本研究的关键技术方法包括：利用X射线晶体学解析C1ql1_gC1q结构；通过冷冻电镜（cryo-EM）解析C1ql1_gC1q六聚体与BAI3_eCUB的复合物结构；采用分子动力学（MD）模拟分析Ca²⁺调控的gC1q结构域构象变化；运用分析型尺寸排阻色谱（aSEC）和等温滴定量热法（ITC）进行体外结合亲和力测定；通过细胞表面招募实验和利用C1ql1基因敲除（KO）小鼠进行体内病毒介导的基因挽救实验，验证关键结构的生理功能。

Domain-swapping drives the hexamer formation of the gC1q domain in C1ql1

研究人员首先发现，C1ql1的C末端球状C1q（gC1q）结构域在溶液中存在两种组装形式：经典的三聚体和一个更大的寡聚体。通过晶体结构解析，他们惊讶地发现，这个更大的寡聚体是一个六聚体，它是由两个三聚体通过“域交换”的方式“尾对尾”结合而成。具体而言，每个三聚体中负责结合Ca²⁺的中心轴在低钙条件下会发生重组，导致其中一个环区（L5-6）构象改变，使其相邻的β4-β5发夹结构得以伸展并“交换”到另一个三聚体上，从而像两把锁的钥匙互相插入对方的锁孔一样，形成了稳定的六聚体。

The hexamer formation of C1ql1_gC1q couples with the partial rearrangement of the central Ca2+-axis

分子动力学模拟结果完美地支持了这一结构观察。模拟显示，当结合在gC1q三聚体中心轴上的四个Ca²⁺离子（从下至上编号为#1-#4）完整时，三聚体结构非常稳定。然而，当顶部的#3和#4 Ca²⁺离子解离时，一个关键的天冬氨酸残基（D208）的配位环境被破坏，其位置被邻近的天冬酰胺（N212）所取代，这大大降低了β4-β5发夹展开的能量壁垒，使得域交换和六聚体形成成为可能。研究人员还设计了D208N（促进六聚化）和A209S（抑制六聚化）两种点突变，并通过色谱分析证实了它们对三聚体-六聚体平衡的预期影响，证明了该转换的可逆性及对Ca²⁺浓度的依赖性。

C1ql1_gC1q interacts with the C-terminal extended CUB domain of BAI3 in a Ca2+-dependent manner

接下来，研究团队着手解析C1ql1与BAI3的结合机制。他们通过结合实验确认，BAI3与C1ql1结合的最小区域是其CUB结构域的一个C端延伸区域（eCUB，氨基酸25-253），并且这一结合严格依赖于Ca²⁺，当缓冲液中Ca²⁺浓度超过0.5 mM时才能有效形成复合物。有趣的是，一旦BAI3结合，它会“锁住”gC1q的构象，阻止其三聚体和六聚体之间的转换。

Cryo-EM structure of the C1ql1_gC1q/BAI3_eCUB complex

为了在原子层面看清它们是如何“握手”的，研究人员利用冷冻电镜技术解析了C1ql1_gC1q六聚体与四个BAI3_eCUB分子形成的复合物结构，整体分辨率约为3.5 ?。结构显示，每个gC1q三聚体部分可以结合两个BAI3_eCUB分子，结合界面位于gC1q的β4、β5和L7-8环形成的裂隙中。最关键的是，一个Ca²⁺离子像“三明治”一样被夹在界面中央，同时被C1ql1上的D193、D235和BAI3上的D63所配位，如同“分子胶水”般稳定了整个复合物。破坏这个界面Ca²⁺的配位或周边关键的氢键相互作用（如C1ql1的Y247A突变，BAI3的T65A/K66A突变），都会严重削弱甚至完全破坏两者的结合。序列分析还表明，与BAI3高度同源的BAI1由于在关键结合位点（E60和T65）上存在氨基酸差异，可能无法与C1qls结合，揭示了该相互作用的亚型特异性。

The central Ca2+-axis allosterically modulates the binding of C1ql1_gC1q to BAI3_eCUB

深入的结构比较发现，gC1q与BAI3的结合能力不仅受界面Ca²⁺的直接影响，还受到其自身中心轴Ca²⁺的变构调节。当中心轴缺少Ca²⁺时（如在六聚体中），其结合BAI3的界面构象会发生改变，不利于结合。实验证实，破坏中心轴Ca²⁺结合的突变（特别是D208N）会显著降低C1ql1与BAI3的亲和力。这表明，中心轴的Ca²⁺占据情况通过变构效应“远程”调控着gC1q与BAI3的“握手”能力。

The gC1q trimer/hexamer transition contributes to the binding of C1ql1 to BAI3 on the cell surface

那么，gC1q的三聚体/六聚体转换在细胞功能上有什么意义呢？细胞实验表明，与BAI3结合能力受损的Y247A突变体一样，促进六聚体形成的D208N突变体在细胞表面被BAI3招募的能力也下降了。而旨在稳定三聚体形式的A209S突变体，虽然在体外表现出更高的单体亲和力，但在细胞表面的富集效果反而弱于野生型。这提示，gC1q介导的C1ql1寡聚化本身，对于其在细胞表面高效组装C1ql1/BAI3复合物至关重要，可能通过多价相互作用增强了结合能力（亲合力）。

C1ql1 forms higher-order oligomers through both NT- and gC1q-mediated hexamers

故事并未结束。全长C1ql1还能形成更高级的寡聚体。电镜分析揭示，这源于两种不同机制形成的六聚体的进一步串联：一种是上述gC1q介导的“尾对尾”六聚体，另一种则是其N端（NT）区域通过保守的半胱氨酸形成二硫键连接而成的“头对头”六聚体（类似于家族另一成员Cbln1）。这两种六聚体可以通过其间的柔性连接区首尾相接，形成一种线性的、蛇形的簇状结构。破坏N端二硫键形成的C2S突变体，虽然仍能形成gC1q六聚体，但其高级寡聚化和在细胞表面被BAI3招募的能力均严重受损。这表明，由NT和gC1q共同介导的C1ql1高阶寡聚化，可能为在突触后膜上有效富集BAI3受体提供了一个理想的分子支架。

The dynamic assemblies of C1ql1 and its interaction with BAI3 are critical for the maintenance of climbing fiber synapses

最后，研究团队在C1ql1基因敲除（KO）小鼠模型中验证了上述分子发现的生理意义。与之前报道一致，敲除C1ql1导致小鼠小脑中CF突触标志物vGluT2的密度显著降低，突触斑点大小异常。更为关键的是，当他们通过病毒向KO小鼠的下橄榄核（CF的起源部位）递送野生型或各种突变型C1ql1进行挽救实验时，发现只有野生型C1ql1能够部分恢复vGluT2斑点的密度。而无论是破坏BAI3结合的Y247A突变体，还是干扰gC1q三聚体/六聚体动态平衡的D208N或A209S突变体，都无法挽救突触表型。这雄辩地证明，C1ql1与BAI3的正常结合，以及其gC1q结构域动态组装的能力，对于体内CF-PC突触的维持都是不可或缺的。

综上所述，本研究不仅首次揭示了C1ql1与BAI3相互作用的高分辨率结构细节，更重要的是发现了一个全新的、受突隙Ca²⁺波动调控的C1ql1寡聚化机制。研究人员提出模型：分泌到突触间隙的C1ql1，首先通过NT区形成二硫键连接的六聚体，进而其gC1q结构域可根据局部Ca²⁺浓度发生域交换，形成另一种六聚体，这两种六聚体可进一步串联成线性簇。这种高阶寡聚体能够通过其多个gC1q结构域，以多价方式高效结合并富集突触后膜上的BAI3受体，从而像“魔术贴”一样稳定突触连接。这项工作将突触组织分子的化学计量学、构象动态与突触可塑性联系起来，为理解神经回路发育和功能提供了新的理论框架，并对相关神经系统疾病的机理探讨具有启示意义。