花椒转录组EST-SSR标记开发与遗传多样性分析：助力分子育种与种质资源可持续利用

《Scientific Reports》：Analysis of EST-SSR characteristics of prickly ash transcriptome and development of molecular markers

本研究针对花椒种质资源分类混乱、遗传背景不清等问题，基于转录组数据开发EST-SSR分子标记，对35份花椒种质进行遗传多样性分析。结果表明，从245,286条Unigene中鉴定出20,271个EST-SSR位点，单核苷酸重复占比最高（44.32%）。22对多态性引物扩增效率达73.33%，多态性比率90.99%。UPGMA聚类将种质分为4类，AMOVA显示79.80%遗传变异存在于个体内。该研究为花椒种质资源评价、分子辅助育种及核心种质筛选提供了基因组学理论支持。

　　

在中国特色经济林木中，花椒（Zanthoxylum bungeanum）作为药食同源的珍贵树种，不仅承载着"绿水青山就是金山银山"的生态价值，更是推动乡村振兴的重要产业支柱。然而令人困扰的是，由于长期依赖传统俗名进行分类，花椒种质资源面临着"同物异名、同名异物"的混乱局面，遗传背景模糊不清，这严重制约了优良品种选育和资源高效利用。更值得注意的是，与辣椒等辛香作物相比，花椒的分子遗传研究基础相对薄弱，亟需开发高效的分子标记技术来破解这一难题。

在这项发表于《Scientific Reports》的研究中，刘嘉敏团队另辟蹊径，将目光投向了表达序列标签-简单序列重复（EST-SSR）这一利器。与传统的基因组SSR相比，EST-SSR直接来源于基因编码区，能够更精准地揭示功能基因的遗传变异，且具有成本低、开发便捷、跨物种通用性强等突出优势。研究人员设想，能否通过转录组测序挖掘花椒的EST-SSR位点，开发多态性分子标记，从而揭开花椒种质资源的遗传多样性面纱？

为了回答这一科学问题，研究团队开展了一项系统性的探索工作。他们首先利用Illumina HiSeq2000高通量测序平台对花椒进行转录组测序，通过Trinity软件组装获得245,286条Unigene序列。接着采用MISA软件进行EST-SSR位点挖掘，并随机设计30对引物进行多态性筛选。最终从全国9个省收集的35份花椒种质中，选取嫩叶样品提取基因组DNA，通过PCR扩增和凝胶电泳检测，利用POPgene、NTSYS等软件进行遗传多样性分析、聚类分析和分子方差分析。

关键技术方法包括：基于Illumina HiSeq2000的转录组测序、MISA软件的EST-SSR位点挖掘、Primer 3.0的引物设计、磁珠法基因组DNA提取、PCR扩增与电泳检测，以及利用POPgene v1.32、NTSYS-pc 2.10、GenAlEx 6.502等软件进行遗传数据分析。实验材料来自重庆文理学院花椒资源圃的35个品种，包括荣昌无刺、哈尼椒、连丰椒等代表性种质。

EST-SSR在花椒转录组中的数量与分布特征

通过对245,286条Unigene序列的挖掘，发现有36,656条序列包含20,271个EST-SSR位点。EST-SSR出现频率（含EST-SSR位点的unigene数与总unigene数的比值）为14.94%，分布频率（EST-SSR位点总数与总unigene数的比值）为8.26%。在重复类型中，单核苷酸重复数量最多，占所有EST-SSR位点的44.32%，其次是三核苷酸（29.47%）和二核苷酸重复（21.97%），而五核苷酸重复最少，仅占0.57%。

花椒转录组EST-SSR基序重复类型与频率特征

研究进一步分析了EST-SSR位点的分布特征，发现单核苷酸重复基序占主导地位，其中A/T基序数量显著高于其他类型，占所有EST-SSR位点的44.11%。在二核苷酸重复基序中，AG/CT是最重要的重复模式，占所有EST-SSR位点的11.35%。三核苷酸重复基序中，AAG/CTT和AAT/ATT占显著比例（分别为579和510个），分别占总EST-SSR位点的2.86%和2.52%。

EST-SSR引物筛选与多态性分析

基于花椒unigene序列，通过Primer 3.0设计了30对EST-SSR引物。经过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测，最终有22对引物扩增出清晰条带，引物扩增效率为73.33%。这22对引物在35份花椒材料中共扩增出105条清晰条带，其中99条为多态性条带，多态性比率达90.99%。引物C12的扩增效率最高，而C3、C13和C30的扩增效率最低。

花椒种质遗传多样性分析

利用22对引物对35份花椒种质资源进行遗传多样性分析，结果显示：22对引物共扩增出42个等位基因（Na），观察等位基因数（Na）范围为1.50-2.00，平均为1.91；有效等位基因数（Ne）范围为1.01-1.80，平均为1.44；Nei's遗传多样性指数（H）范围为0.01-0.44，平均为0.27；Shannon信息指数（I）范围为0.04-0.63，平均为0.41；多态性信息含量（PIC）范围为0.01-0.35，平均为0.25。其中引物C25在有效等位基因数、Nei's遗传多样性指数、Shannon信息指数和PIC方面均表现最佳，表明其在揭示花椒种质遗传差异方面具有更强的分辨能力。

花椒种质亲缘关系

遗传一致性和遗传距离是量化群体间亲缘关系远近的核心参数。研究结果显示，35份试验材料间的遗传一致性系数在0.3200-0.9111之间，遗传距离在0.0931-1.1394之间。其中山西运城的"八月红"与云南曲靖的"三岔河花椒"遗传一致性最高（0.9111），遗传距离最小（0.0931），亲缘关系最近；而云南永善的"永青1号"与云南昭通的"云南青花椒"遗传一致性最低（0.3200），遗传距离最大（1.1394），亲缘关系最远。

花椒种质UPGMA聚类结果分析

基于22对多态性引物的扩增数据，对35份花椒种质资源进行UPGMA聚类分析。聚类图的Cophenetic相关系数为0.79，T值为7.87，P值小于0.05，表明聚类结果理想，可靠性高。从EST-SSR标记聚类图可以看出，35份花椒种质资源被分为4个大类：第I类包括13份种质，如四川雅安的"汉源花椒"、河南焦作的"九月红"、日本朝仓的"朝仓山椒"等；第II类包含20份花椒种质，其中四川2份、甘肃1份、陕西3份、云南7份，其余来自重庆；第III和第IV类分别只有云南昭通的"云南青花椒"和云南永善的"永青1号"各种质。聚类分析结果表明，部分来自同一地区的种质资源并未聚集在一起，而一些来自不同地区的种质却被归为同一类。

花椒种质PCoA主坐标分析

在聚类分析基础上，根据Nei's遗传距离对四类花椒进行主坐标分析（PCoA）。结果显示，第一主坐标对花椒种质总遗传变异的贡献率为38.90%，第二主坐标贡献率为13.44%，两个主坐标特征值累计贡献率为52.34%。35份花椒种质在平面坐标图中大致可分为四个区域，第I和第II类分布相对集中，第III和第IV类遗传距离最大，亲缘关系最远，遗传背景差异显著。UPGMA聚类分析与PCoA结果高度一致，两种方法的结论可相互验证。

AMOVA分子方差分析

AMOVA分子方差分析结果表明：花椒的遗传变异主要来源于个体内，占总变异的79.80%，这表明开发的EST-SSR标记在花椒个体水平上具有较高的多态性和个体杂合度；群体间的遗传变异占总变异的12.40%，群体内个体间的变异占7.80%。基于方差组分计算的群体遗传分化系数（Fst）为0.12，表明花椒群体间存在中等程度的遗传分化。

研究结论与意义

本研究通过花椒转录组测序，从245,286条Unigenes中筛选出20,271个EST-SSR位点，主要以单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸重复为主。随机选取30对引物对35份花椒种质进行多态性筛选，获得22对多态性引物。通过UPGMA聚类分析将35份花椒种质分为4类，筛选出的多态性标记能有效反映花椒种质间的遗传关联性和遗传多样性，为遗传图谱构建和种质资源鉴定提供了标记资源储备。

值得注意的是，研究发现花椒种质的遗传关系与其地理起源并非绝对对应，这可能源于早期人工引种导致部分产区共享相似的遗传背景，以及长期人为干预下的高频基因交流推动了跨区域基因流动。AMOVA分析进一步揭示，花椒遗传变异主要存在于个体水平（79.80%），群体间分化处于中等水平（Fst=0.12），这一发现为花椒种质资源的保护与利用策略提供了重要依据。

该研究开发的EST-SSR标记体系不仅为花椒种质资源精准鉴定、核心种质筛选和分子辅助育种提供了关键技术支撑，也为其他木本植物遗传多样性研究提供了可借鉴的方法学框架。随着多组学驱动育种时代的到来，这项研究成果将有力推动花椒育种创新和产业可持续发展。