新型抗菌肽Ib-M1与绿色合成氧化锌纳米颗粒协同抗幽门螺杆菌生物膜及毒力作用研究

《Scientific Reports》：Evaluation of antimicrobial and antibiofilm activities of peptide Impatiens balsamina-M1 and Zinc oxide nanoparticles against Helicobacter pylori

本研究针对幽门螺杆菌（H. pylori）耐药性及生物膜形成难题，创新性评估抗菌肽Ib-M1与植物合成ZnO NPs的协同抗菌效应。结果表明联合疗法可显著下调cagA、vacA等毒力基因表达，破坏生物膜结构并抑制细菌入侵宿主细胞，为抗H. pylori治疗提供环境友好型新策略。

　　

在全球范围内，约半数人口的胃黏膜中潜伏着一种螺旋状的革兰氏阴性菌——幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）。这种微生物不仅是慢性胃炎和消化性溃疡的主要元凶，更被世界卫生组织列为I类致癌物，与胃腺癌和黏膜相关淋巴组织淋巴瘤的发生密切相关。然而，随着克拉霉素和甲硝唑等标准治疗药物的耐药率分别攀升至25%和65%，传统疗法正面临严峻挑战。更棘手的是，H. pylori能够形成生物膜（biofilm），这种由细菌分泌的胞外聚合物构成的保护性屏障，可显著增强细菌对抗生素的耐受性，成为根除治疗中的“顽固堡垒”。

面对这一困境，科学家将目光投向两类新兴抗菌剂：抗菌肽（Antimicrobial Peptides, AMPs）和纳米颗粒。抗菌肽是天然存在或人工合成的小分子多肽，可通过破坏细菌膜结构快速杀灭病原体；纳米颗粒则以其独特的物理化学性质，如释放金属离子和产生活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）的能力，展现出广谱抗菌活性。其中，氧化锌纳米颗粒（Zinc Oxide Nanoparticles, ZnO NPs）因良好的生物相容性和抗菌效果备受关注，但传统化学合成方法存在环境污染隐患。为此，研究者采用绿色合成技术，利用植物提取物中的生物活性成分替代有毒化学品，在提升纳米材料生物活性的同时兼顾生态友好性。

本研究创新性地将源自凤仙花（Impatiens balsamina）的合成抗菌肽Ib-M1与采用加辛尼阿尼维菊（Anvillea garcinii）提取物绿色合成的ZnO NPs联合使用，系统评估二者对H. pylori的抗菌、抗生物膜及抑制宿主细胞入侵的效果。论文发表于《Scientific Reports》，通过多维度实验揭示该联合策略在降低细菌毒力、破坏生物膜结构和减少细胞毒性方面的协同作用，为对抗耐药性H. pylori感染提供了新思路。

研究团队主要采用以下关键技术方法：首先通过动态光散射（DLS）、扫描电镜（SEM）和X射线衍射（XRD）表征ZnO NPs的理化性质；采用微量肉汤稀释法测定最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）；通过棋盘法计算分级抑菌浓度指数（FICI）评估协同作用；使用结晶紫染色量化生物膜形成能力；结合qRT-PCR技术分析cagA、vacA、ureA、hspR和spoT等毒力基因表达；利用流式细胞术和菌落计数法定量细菌对AGS胃上皮细胞的侵袭率；并通过MTT法评估细胞毒性。研究样本包括3株临床分离的H. pylori菌株（BY-1、OC-824和MZ-1），其中两株对克拉霉素和甲硝唑双重耐药，一株仅对甲硝唑耐药。

2.1. ZnO NPs的表征

通过调节合成pH值（8-12）和干燥温度（60°C/500°C），成功制备出球形ZnO NPs。DLS显示粒径范围为16.4-63.0 nm，其中pH 12、60°C干燥的NPs粒径最小（16.4±0.9 nm），且稳定性最高。XRD证实其具有六方纤锌矿晶体结构，Scherrer方程计算显示60°C干燥的NPs结晶尺寸（14.87 nm）小于500°C样品（20.38 nm）。

FTIR光谱表明植物提取物中的生物分子有效包覆于NPs表面，增强其稳定性。抗氧化试验显示两种ZnO NPs的IC₅₀均高于500 μg/mL，且抗菌试验证实pH 12制备的NPs对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果最优（MIC=125 μg/mL），故后续实验选用该条件合成的NPs。

2.3. ZnO NPs和Ib-M1对H. pylori的抗菌活性

ZnO NPs对3株H. pylori的MIC值为16-32 μg/mL，显著低于Ib-M1的500-1000 μg/mL。棋盘试验显示，联合用药对BY-1菌株产生相加作用（FICI=0.98），而对OC-824和MZ-1菌株表现为无关作用（FICI=1.51/1.47）。

2.5. 抗生物膜活性评估

联合疗法显著降低最小生物膜清除浓度（MBEC）。以BY-1为例，单用ZnO NPs或Ib-M1的MBEC分别为128 μg/mL和2000 μg/mL（均为4×MIC），而联合用药时仅需32.25 μg/mL ZnO NPs+250 μg/mL Ib-M1（2×MIC ZnO NPs+0.5×MIC Ib-M1）即可实现同等效果。

2.6. 生物膜破坏的SEM分析

扫描电镜显示，未处理组（图4A）的生物膜结构致密且细菌形态完整；单用ZnO NPs（图4B）或Ib-M1（图4C）可引起细菌分散和膜皱缩；而联合处理（图4D）导致生物膜完全崩解，细菌表面出现严重损伤。

2.7. H. pylori毒力因子基因表达

qRT-PCR结果表明，所有处理均显著下调cagA、vacA、ureA、hspR和spoT基因表达（p<0.0001）。其中联合用药对MZ-1菌株的抑制效果最显著，例如vacA表达降低至对照组的20%。

2.8. AGS细胞中H. pylori侵袭的流式分析

流式细胞术显示，联合处理将FITC标记的H. pylori入侵率从对照组的21.9%降至3.6%，显著优于单药处理（ZnO NPs组10.57%，Ib-M1组8.06%）。菌落计数实验进一步证实联合用药使细菌侵袭率降低85%。

2.10. 细胞活性评估

MTT实验显示ZnO NPs、Ib-M1和联合用药的IC₅₀分别为48.19 μg/mL、1362 μg/mL和145.6 μg/mL（ZnO NPs）+250 μg/mL（Ib-M1）。联合用药中ZnO NPs的选择性指数（SI=IC₅₀/MIC）升至9.3，表明其安全性显著提高。

本研究证实，绿色合成的ZnO NPs与Ib-M1肽的联合应用可通过多重机制协同抑制H. pylori：在物理层面破坏生物膜结构，在分子层面下调毒力基因表达，在细胞层面阻断细菌入侵宿主细胞。尤其值得注意的是，联合疗法在亚抑菌浓度（1/2 MIC）下即可显著抑制细菌侵袭，且通过植物活性成分的包覆作用降低ZnO NPs的细胞毒性，展现出优异的生物安全性。尽管不同菌株对联合用药的响应存在差异（可能与膜脂组成或外排泵活性有关），但该策略为克服H. pylori耐药性提供了新思路。未来研究需进一步探索纳米颗粒-多肽复合物的体内药代动力学及其对胃微生态的长期影响，以推动这一绿色抗菌策略的临床转化。