整合蛋白质组与代谢组学揭示巨噬细胞相关信号作为口腔鳞状细胞癌的潜在生物标志物

《Scientific Reports》：Integrated proteomics and metabolomics analysis revealed that macrophage-related signals may be potential biomarkers for oral squamous cell carcinoma

本研究针对口腔鳞状细胞癌(OSCC)蛋白和代谢层面改变机制不清的问题，通过整合蛋白质组、代谢组、空间转录组和单细胞RNA测序技术，系统比较OSCC肿瘤与癌旁组织。研究发现免疫相关蛋白ARPC4显著上调且与不良预后相关，鉴定出C1QC阳性巨噬细胞(Macro_C1QC)为关键免疫细胞亚群，并揭示色氨酸代谢通路异常可能通过重塑巨噬细胞表型促进OSCC进展，为OSCC提供了新型预后标志物和治疗靶点。

　　

口腔鳞状细胞癌(Oral Squamous Cell Carcinoma, OSCC)是全球头颈部最常见的恶性肿瘤之一，据世界卫生组织统计，2020年全球新增口腔癌病例约37.7万，死亡约17.7万，发病率在过去十年呈持续上升趋势。尽管手术、放疗和化疗技术不断进步，但由于肿瘤异质性大、早期转移倾向强及治疗抵抗等因素，OSCC患者的5年生存率仍低于60%，晚期患者预后更差。因此，阐明OSCC发生发展的分子机制，寻找新的诊断生物标志物和治疗靶点成为亟待解决的临床挑战。

近年来，基因组学和转录组学技术的显著进展为理解OSCC的分子基础提供了重要见解，然而，蛋白质作为生命活动的直接执行者，其表达和功能改变与肿瘤表型关系更为密切。同时，代谢重编程是肿瘤的典型特征之一，代谢物的变化直接影响肿瘤细胞的恶性行为及其与微环境的相互作用。尽管已有研究从不同角度探讨OSCC，但蛋白质水平和代谢层面的改变驱动疾病进展的机制仍不清楚，特别是免疫细胞与代谢重塑在OSCC微环境中的相互作用尚未系统阐明。

针对这一科学问题，杨宝贵等人的研究团队在《Scientific Reports》上发表了题为"Integrated proteomics and metabolomics analysis revealed that macrophage-related signals may be potential biomarkers for oral squamous cell carcinoma"的研究论文，通过整合多组学分析，系统比较了OSCC肿瘤组织与匹配癌旁组织的蛋白表达、免疫调节和代谢差异，旨在揭示OSCC发病的新分子机制。

研究团队收集了9例OSCC患者的肿瘤组织和5例癌旁组织，采用液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)技术进行蛋白质组和代谢组分析，并结合公共数据库中的单细胞RNA测序数据、空间转录组数据和病理检查数据，构建了一个多维分析框架。关键技术方法包括：基于DIA（数据非依赖采集）模式的蛋白质组定量分析，采用液相色谱-质谱联用(LC-MS)的代谢组学分析，利用Seurat包进行的单细胞RNA测序数据分析，基于空间转录组数据的基因集变异分析(GSVA)，以及通过Spearman相关分析构建的蛋白质-代谢物调控网络。

2.1 蛋白质组和代谢组谱分析

研究首先对OSCC患者的肿瘤组织和癌旁组织进行了全面的蛋白质组和代谢组分析。质量控制显示蛋白质组数据的肽段质量误差分布符合正态分布，所有误差均在±10 ppm范围内，样本间蛋白定量值的相对标准偏差(RSD)小于0.3，表明定量重复性良好。

分析结果显示，肿瘤组织平均检测到6241种蛋白质，显著多于癌旁组织的4311种，表明肿瘤组织中蛋白表达谱更为紊乱。代谢组学分析检测到肿瘤组织平均有685种代谢物，癌旁组织有693种，数量相近。聚类分析显示，基于蛋白质组和代谢组数据，同组样本有聚集趋势，表明组内一致性良好。

2.2 差异蛋白分析及验证

主成分分析(PCA)显示肿瘤和癌旁组织样本在主要成分上存在显著差异。差异表达分析共鉴定出943个差异表达蛋白(DEPs)，其中351个在肿瘤组织中上调，583个下调。

这些差异蛋白主要定位于细胞质、线粒体和质膜。研究人员随机选择了10个DEPs（YTHDF2、VAV2、RAB13、FEN1、P4HB、JUND、OGN、PFKM、DLD和ACADS），利用人类蛋白质图谱(HPA)数据库中的头颈鳞癌(HNSC)数据验证其表达水平。结果显示YTHDF2、VAV2、RAB13和FEN1在肿瘤组织中显著高表达，而JUND、OGN、PFKM、DLD和ACADS在癌旁组织中高表达。免疫组化结果进一步证实了这些发现。

空间转录组分析显示，上调蛋白主要富集于肿瘤区域，而下调蛋白主要富集于肌肉、血管和腺体区域，提示不同组织区域对蛋白质表达谱的贡献不同。

2.3 免疫相关蛋白富集及预后价值

功能分析发现，351个肿瘤组织中上调的蛋白有110个与免疫系统相关，30个与免疫疾病相关，表明肿瘤微环境中存在深刻的免疫失调。

KEGG富集分析显示"抗原加工和呈递"及"FcγR介导的吞噬作用"是两个显著富集的免疫相关通路。"FcγR介导的吞噬作用"通路中有8个DEPs，包括此前报道可促进胃癌进展的VAV2蛋白。"抗原加工和呈递"通路中也鉴定出8个蛋白。HPA数据库验证显示，ARPC4、CFL2、FCGR3B、PLPP3和SYK在肿瘤组织中表达显著差异。

临床相关性分析发现，高ARPC4表达与患者较差生存显著相关，这一发现在两个独立的GEO数据集（GSE42743和GSE75538）和TCGA头颈鳞癌(HNSC)队列中得到验证。高ARPC4表达与总生存期(P=0.017)和无病生存期(P=0.02)降低显著相关，表明其作为预后生物标志物的潜力。

2.4 C1QC阳性巨噬细胞浸润与预后

为探究差异表达免疫相关蛋白的来源和作用机制，研究人员分析了已发表的OSCC单细胞RNA测序数据。GSVA富集分析显示这些基因主要在巨噬细胞中富集，蛋白质组学鉴定的差异表达蛋白SYK和VAV2也在巨噬细胞中差异表达。

对巨噬细胞数据重新聚类后鉴定出7个细胞亚群，最终注释为cDC_CD1C、Macro_C1QC、Macro_FCN1、Macro_MKI67和pDC_LILRA4。单细胞测序的细胞比例数据显示，Macro_C1QC细胞在肿瘤组织中的比例显著高于癌旁组织。蛋白质组学鉴定的差异蛋白SYK和ARPC4在Macro_C1QC簇中高表达，表明OSCC组织中Macro_C1QC的富集可能导致FcγR介导的吞噬作用和抗原加工呈递信号通路的改变。

利用OSCC队列数据(GSE42743)分析发现，C1QC在肿瘤组织中上调，其高表达水平与OSCC患者不良预后显著相关。

2.5 代谢物差异分析

代谢组学分析显示，肿瘤组织样本和癌旁组织样本在正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)中明显分离。共鉴定出100个上调和107个下调的代谢物。

比较代谢组学分析显示，肿瘤和癌旁组织在七大类代谢物中存在显著异质性。KEGG通路富集分析表明，这些差异代谢物主要与细胞增殖/凋亡和膜转运功能有关。人类疾病通路中最富集差异代谢物的是"癌症：概述"，而最显著富集的代谢通路是氨基酸代谢。

网络分析发现肿瘤组织中存在不同的氨基酸代谢模式：上调代谢物主要集中在半胱氨酸和蛋氨酸代谢以及色氨酸代谢通路，而下调代谢物主要富集于精氨酸和脯氨酸代谢。特别值得注意的是色氨酸(Trp)代谢，其在免疫调节和肠道稳态中起关键作用。

2.6 整合蛋白质组和代谢组分析

为分析OSCC中蛋白质和代谢物的协同机制，研究人员计算了已鉴定差异代谢物与差异蛋白之间的相关性。选取相关性系数高于0.8且P<0.05的前200个蛋白质-代谢物对进行相关性网络分析。

在肿瘤组织中，短肽异亮氨酸(Ala-Ile和Ile-Val)和丝氨酸(Ser-Ile和Ser-Tyr)与大多数差异表达蛋白的丰度呈负相关，而L-脯氨酰-L-异亮氨酸和N-乙酰组氨酸与更多差异表达蛋白的丰度呈正相关。

对差异蛋白和代谢物整合列表进行Fisher精确检验发现，色氨酸代谢通路仍然被代谢物和差异蛋白显著富集。进一步对蛋白质组和代谢组数据共同富集的KEGG通路进行网络分析显示，"化学致癌作用"过程包含最多富集的差异代谢物和蛋白质。该网络还包括色氨酸代谢失调导致的L-犬尿氨酸代谢失衡，这是肿瘤组织中常见的代谢紊乱。

KEGG通路可视化分析显示，色氨酸代谢通路中多达12个因子受到影响，表明该代谢途径发生改变。

4. 讨论与结论

该研究通过整合多组学分析，系统描绘了OSCC的蛋白质组和代谢组图谱，为未来研究提供了宝贵的数据资源。更重要的是，研究揭示了免疫相关蛋白失调及其与特定巨噬细胞亚群(Macro_C1QC)在OSCC进展中的关键作用，提出了色氨酸代谢调节巨噬细胞功能的新机制。

研究发现免疫相关蛋白(VAV2、ARPC4、FCGR3B、SYK和HSPA5)在肿瘤组织中相较于癌旁组织显著上调，且其过表达与恶性特征强相关。尤其值得注意的是，ARPC4的高表达与不良临床结局相关，表明其作为治疗靶点的潜力。

一个关键发现是鉴定出C1QC阳性巨噬细胞亚群(Macro_C1QC)为OSCC的关键参与者。单细胞RNA测序显示其在肿瘤中显著富集，高浸润水平预测患者预后不良。研究人员推测Macro_C1QC作为肿瘤相关巨噬细胞(TAM)亚群，通过以下机制加剧OSCC进展：(1)分泌促炎细胞因子(如IL-6、TNF-α)塑造免疫抑制微环境；(2)释放基质重塑酶(如MMP9)促进细胞外基质降解和转移。

色氨酸代谢失衡与癌症发病机制密切相关，并可影响巨噬细胞极化。整合蛋白质组和代谢组分析提供了与这一假设一致的相关性证据，揭示了OSCC中色氨酸代谢通路的显著失调。研究发现色氨酸相关代谢物发生明显改变，并鉴定出12个下调因子，包括IDO1/TDO驱动的犬尿氨酸轴中的关键酶。由于该通路对建立免疫耐受至关重要，其失调可能使Macro_C1QC细胞向促肿瘤表型极化。反过来，这些重编程的巨噬细胞可能通过分泌炎症细胞因子和基质重塑因子促进侵袭。

该研究也存在一些局限性。多组学分析的高成本限制了蛋白质组和代谢组分析的样本量较小，研究结果需要在更大的独立队列中验证。此外，已识别的巨噬细胞参与OSCC进展的潜在机制是相关性的，需要通过体外和体内实验进行功能验证。

总之，该研究提供了OSCC的综合蛋白质组和代谢组图谱，鉴定出ARPC4作为具有显著预后价值的免疫相关蛋白。研究系统性地确定了Macro_C1QC巨噬细胞是与患者不良结局密切相关的关键免疫浸润细胞。整合多组学分析显示，失调的色氨酸代谢可能通过调节巨噬细胞功能促进OSCC进展。这些发现为理解OSCC肿瘤微环境的复杂性提供了更深入的见解，并为开发新型预后生物标志物和靶向治疗策略提供了有希望的方向。