活性氧响应性头孢氨苇-透明质酸共聚物纳米粒用于口腔软组织炎症与感染的靶向治疗

《Scientific Reports》：Reactive oxygen species-sensitive release of cephalexin from hyaluronic acid-g-cephalexin dimer copolymer for treatment of inflammation and infection of oral soft tissue cells

本研究针对口腔软组织炎症与感染环境中活性氧(ROS)水平升高及CD44受体高表达的特点，构建了基于透明质酸(HA)和头孢氨苇(CPX)二聚体的智能纳米递送系统(HAgCPX)。结果表明，该纳米粒具备ROS触发释药特性，能通过CD44受体介导途径靶向炎症细胞，有效抑制促炎因子(IL-6、TNF-α)分泌并促进伤口愈合，同时保持与游离CPX相当的广谱抗菌活性，为口腔炎性疾病的靶向治疗提供了新策略。

　　

口腔是一个复杂且独特的微环境，其中的软组织炎症和感染，如牙龈炎、牙周炎等，不仅是导致牙齿松动、脱落的直接原因，更与全身性疾病如糖尿病、关节炎、心脏病等密切相关。然而，传统的抗生素全身给药在治疗口腔局部感染时面临巨大挑战：药物难以有效富集在感染部位，口腔中的唾液、食物残渣以及复杂的物理化学环境会影响药效，且长期使用易导致细菌耐药性和全身性副作用。因此，开发能够精准靶向口腔感染部位、并响应局部病理微环境智能释药的递送系统，成为口腔医学领域亟待突破的关键问题。

值得注意的是，当口腔软组织发生炎症或感染时，其局部微环境会发生一系列特征性变化。研究表明，炎症细胞会高表达一种名为CD44的受体，同时，由于免疫细胞激活和细菌活动，局部会产生高水平的活性氧(ROS)。这“两高一升”（CD44受体高表达、ROS水平升高）的病理特征，为设计靶向药物递送系统提供了绝佳的“路标”和“开关”。基于此，研究人员设想：能否设计一种纳米药物，既能像“精确制导导弹”一样识别并锚定在表达CD44受体的炎症细胞上，又能像“环境感应炸弹”一样在ROS水平升高的感染部位快速释放抗生素，从而实现高效、低毒的治疗？

为了验证这一设想，由Kim C., Kim W., Kook M.等研究人员在《Scientific Reports》上发表了他们的最新成果。他们成功合成了一种新型的智能纳米粒——活性氧敏感的头孢氨苇-透明质酸接枝共聚物纳米粒(HAgCPX NP)。该研究的核心策略是巧妙利用化学合成技术，将广谱抗生素头孢氨苇(CPX)通过一个对ROS敏感的硫缩酮(Thioketal)连接头连接成二聚体(CPX dimer)，再将此二聚体接枝到天然靶向分子透明质酸(HA)的骨架上。透明质酸是CD44受体的天然配体，犹如一把“钥匙”，能精准识别炎症细胞表面的CD44受体这把“锁”，从而实现纳米粒的主动靶向。而硫缩酮连接头则在ROS富集的炎症环境中断裂，触发抗生素的快速释放。

为开展本研究，研究人员主要运用了以下关键技术：首先，通过化学偶联法合成CPX二聚体及HAgCPX共聚物，并利用核磁共振氢谱(¹H NMR)和高分辨质谱(HR-TOF)进行结构确证；其次，采用透析法制备HAgCPX纳米粒，并通过透射电镜(TEM)和动态光散射法(DLS)表征其形貌、粒径及ROS响应性降解行为；最后，以人牙龈成纤维细胞(HGF-1)为体外模型，综合运用细胞活力检测(MTT法)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、细胞划痕实验、流式细胞术、荧光显微镜等技术，系统评估了纳米粒的细胞毒性、抗炎效应、促愈合能力、CD44受体介导的细胞摄取以及抗菌活性。

研究结果

1. HAgCPX纳米粒的成功构建与ROS敏感性验证

研究人员成功合成了HAgCPX共聚物，产率高达93%以上。该共聚物能在水溶液中自组装形成粒径约292纳米的球形纳米粒，分布均一。最关键的是，这些纳米粒对ROS表现出显著的敏感性。在含有过氧化氢(H₂O₂)的环境中，纳米粒的形貌从规整的球形变为扭曲、破碎的结构，粒径分布也从单峰变为多峰，表明其结构发生了 disintegration（解离）。紫外光谱分析显示，加入H₂O₂后，纳米粒的紫外吸收图谱变得与游离CPX相似，证明CPX被释放出来。药物释放实验进一步证实，H₂O₂浓度越高，CPX的释放速率越快。这些结果共同表明，HAgCPX纳米粒具备良好的ROS响应性释药能力。

2. 优异的生物相容性与抗炎/促愈合功效

细胞实验表明，HAgCPX纳米粒对人牙龈成纤维细胞(HGF-1)和小鼠成纤维细胞(L929)均无明显毒性，细胞存活率保持在80%以上，显示出良好的生物相容性。在脂多糖(LPS)诱导的HGF-1细胞炎症模型中，HAgCPX纳米粒能有效逆转LPS引起的细胞活力下降，显著抑制关键促炎因子白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的分泌，其效果与游离CPX相当。更为重要的是，细胞划痕实验显示，HAgCPX纳米粒能显著促进LPS处理后的HGF-1细胞的迁移，加速“伤口”愈合。流式细胞术分析也表明，纳米粒处理能减少LPS诱导的细胞凋亡和坏死。这些结果凸显了HAgCPX纳米粒在缓解炎症、促进组织修复方面的巨大潜力。

3. CD44受体介导的靶向递送机制证实

研究发现了支持其靶向设计的关键证据。一方面，LPS刺激能显著上调HGF-1细胞表面CD44受体的表达。另一方面，当用游离的HA预先封闭细胞表面的CD44受体后，HAgCPX纳米粒进入细胞的量（通过荧光标记检测）明显减少；而在未封闭的细胞中，纳米粒则能被高效摄取。这种竞争性抑制实验有力地证明了HAgCPX纳米粒是通过CD44受体介导的途径被细胞摄取的。进一步的细胞因子实验发现，用游离HA阻断CD44受体后，HAgCPX纳米粒的抗炎效果（抑制IL-6和TNF-α分泌）被削弱，而游离CPX的效果则不受影响。这从功能层面证实了其CD44受体依赖的靶向治疗作用。

4. 保留强效的抗菌活性

尽管CPX是以二聚体形式被连接到纳米粒上，但HAgCPX纳米粒在体外对多种口腔常见细菌（如变异链球菌(S. mutans)、表皮葡萄球菌(S. epidermidis)、枯草芽孢杆菌(B. subtilis)和大肠杆菌(E. coli)）均表现出与游离CPX相近的抗菌活性。无论是纸片扩散法显示的抑菌圈大小，还是细菌生长曲线监测，都证实了纳米粒能有效抑制细菌生长。这表明在ROS环境下释放出的CPX二聚体或其降解产物仍能保持有效的抗菌功能。

结论与意义

该项研究成功设计并构建了一种基于透明质酸和头孢氨苇的智能响应型纳米药物递送系统(HAgCPX NP)。该系统创新性地将CD44受体的靶向性与ROS的响应性释药机制相结合，实现了“双靶向”策略：空间靶向（炎症部位）和微环境靶向（ROS触发）。研究结果表明，HAgCPX纳米粒不仅能有效靶向炎症口腔软组织细胞，在ROS刺激下快速释放抗生素，发挥强大的抗炎和促愈合作用，还能保持广谱的抗菌活性，且本身具有良好的生物安全性。

这项工作的重要意义在于，它为解决口腔局部感染性疾病中抗生素靶向递送效率低、副作用大的难题提供了一个极具前景的新方案。这种“智能”纳米粒能够利用疾病微环境的独特特征进行精准药物投递，不仅提高了治疗效果，有望降低用药剂量和频率，从而减少耐药性的产生，也为开发治疗其他伴有氧化应激和特定受体高表达的炎性疾病（如关节炎、肠道炎症等）的靶向纳米药物提供了新的思路和借鉴。该研究标志着口腔疾病靶向治疗向精准化、智能化迈出了重要一步。