缺氧与炎症协同作用下血管内皮细胞单层动态功能改变及其在脓毒症病理机制中的研究

《Scientific Reports》：Dynamic and functional changes in vascular endothelial cell monolayers under combined hypoxic and inflammatory stimuli

本研究针对脓毒症中缺氧与炎症协同作用导致血管内皮功能障碍的机制尚不明确的问题，通过微流控技术精确控制氧环境，模拟脓毒症病理状态下缺氧与LPS炎症刺激共存的条件，系统研究了血管内皮细胞单层的集体迁移、通透性及关键蛋白表达的变化。结果发现LPS可延缓缺氧诱导的细胞迁移抑制，特定浓度LPS预处理可部分抑制缺氧增加的通透性，并揭示了HIF-1α与NF-κB信号通路间的复杂交互作用。该研究为理解脓毒症血管功能障碍提供了新的体外模型和机制见解。

　　

在人类与疾病的漫长斗争中，脓毒症始终是重症监护病房里一个令人闻之色变的“杀手”。当病原体入侵人体，免疫系统本应有序抵抗，但有时却会失控地“疯狂反击”，释放大量炎症因子，引发全身炎症反应综合征，最终可能导致多器官衰竭。在这个过程中，微血栓形成、组织水肿以及免疫细胞耗氧增加等因素共同导致了组织缺氧。血管内皮细胞作为血管内壁的“守护者”，首当其冲地承受着血液中化学物质和氧气浓度变化的双重冲击。然而，传统研究大多单独考察缺氧或炎症的影响，且在实验设计中往往忽略了人体内实际的生理性缺氧环境（动脉血约13.2% O₂，静脉血约5.3% O₂），使得我们对脓毒症中内皮细胞真实处境的理解存在空白。

为了解决这一难题，来自日本东北大学（Tohoku University）的研究团队Kazuki Sone、Ai Funatsu、So Sampei和Kenichi Funamoto教授在《Scientific Reports》上发表了一项创新研究。他们利用自主研发的微流控设备，如同为细胞打造了一个可精确调控的“人工微环境”，首次实时观察了血管内皮细胞在同时承受缺氧和脂多糖（LPS，一种模拟细菌感染的炎症刺激物）刺激下的动态变化，揭示了细胞迁移、屏障功能以及关键信号通路的复杂互动，为理解脓毒症血管病理生理提供了宝贵见解。

本研究的关键技术方法主要包括：1）使用可精确控制氧浓度的双层微流控设备培养人脐静脉内皮细胞（HUVECs）单层；2）通过粒子图像测速技术分析时间序列相差显微镜图像，量化集体细胞迁移；3）通过荧光标记葡聚糖扩散实验评估单层通透性；4）利用免疫荧光染色和共聚焦显微镜观察细胞间粘附分子（ICAM-1, VCAM-1）、血管内皮钙粘蛋白（VE-cadherin）、缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）和核因子κB（NF-κB）的表达与定位；5）使用NF-κB转录活性抑制剂PFI-1进行机制验证。

集体细胞迁移受缺氧和炎症刺激的复杂调控

研究人员发现，内皮细胞的迁移能力高度依赖于氧气环境。在常氧（21% O₂）下，急性LPS刺激对细胞迁移速度影响不大。然而，在严重缺氧（1.3% O₂）环境下，细胞迁移速度会迅速下降，这被认为是细胞有氧能量生产减少所致。有趣的是，当同时施加LPS炎症刺激时，情况发生了变化。高浓度LPS（1 μg/mL）的刺激似乎“压倒”了缺氧的影响，使细胞迁移速度在实验期间得以维持，不像单纯缺氧那样下降。而低浓度LPS（0.1 μg/mL）仅在最初2小时内延缓了迁移速度的下降，之后缺氧的影响仍占主导。当模拟慢性炎症状态（LPS预处理24小时）时，细胞迁移速度在各种条件下普遍下降，表明长期炎症刺激会削弱细胞的迁移能力。使用NF-κB抑制剂PFI-1处理后，高浓度LPS在缺氧下特有的迁移维持效应消失了，迁移速度显著降低，证实了NF-κB信号通路在这一过程中的关键作用。

血管内皮细胞单层通透性的变化

血管内皮的一个重要功能是维持选择性屏障，防止血液成分随意泄漏。通过测量不同分子量（10, 40, 70 kDa）的荧光葡聚糖通过细胞单层的扩散速率，研究人员评估了通透性。结果表明，无论是缺氧还是LPS刺激，都会增加内皮单层的通透性，且其大小选择性屏障功能减弱。在常氧下，通透性随LPS浓度增加而增加。在缺氧条件下，通透性普遍高于常氧对照，说明缺氧对增加通透性的影响比急性炎症刺激更显著。一个值得注意的发现是，在慢性炎症（LPS预处理）条件下，特定低浓度LPS（0.1 μg/mL）反而部分抑制了缺氧引起的通透性增加，提示适度的长期炎症刺激可能触发某种保护性机制。

粘附和信号蛋白的表达与定位

为了探究上述功能变化背后的分子机制，研究团队通过免疫荧光染色观察了关键蛋白的表达。细胞粘附分子ICAM-1和VCAM-1在炎症反应中促进免疫细胞粘附至血管壁。结果显示，在常氧下，LPS刺激显著增加了ICAM-1和VCAM-1的表达。然而，在缺氧环境下，VCAM-1的表达增加被显著抑制，这与既往报道缺氧可独立于NF-κB抑制VCAM-1表达的结果一致。负责细胞间连接的VE-cadherin在不同条件下未观察到明显变化，表明在此模型中其对迁移和通透性变化的直接贡献可能有限。作为缺氧反应的核心调控因子，HIF-1α在缺氧条件下稳定并核转位。有趣的是，低浓度LPS即使在常氧下也能促进HIF-1α的核转位，且这种变化趋势与NF-κB的核内强度变化一致，提示NF-κB可能参与了LPS诱导的HIF-1α激活。而在高浓度LPS和缺氧同时存在的特定条件下（细胞迁移得以维持），HIF-1α的核转位比率相对较低，暗示HIF-1α活性与细胞迁移能力之间存在关联。炎症核心转录因子NF-κB在LPS刺激1小时后核内强度即增加，尤其在低浓度LPS下最为显著。

研究结论与意义

综上所述，这项研究清晰地表明，缺氧和炎症刺激共同作用于血管内皮细胞时，会产生复杂而非简单叠加的效应。LPS引起的炎症刺激可以在特定条件下延缓或减弱缺氧对细胞迁移的抑制作用，而缺氧对增加血管通透性的影响则更为显著。这些动态和功能变化背后，涉及HIF-1α和NF-κB信号通路之间复杂的相互作用。NF-κB信号的激活被证明是LPS影响细胞迁移和通透性的关键环节。

该研究的创新之处在于利用先进的微流控技术，在体外成功模拟了脓毒症关键病理特征——缺氧与炎症并存的环境，并对内皮细胞的功能进行了多维度、动态的量化分析。这不仅为理解脓毒症中血管功能障碍的机制提供了新的视角和实验证据，而且所建立的模型和方法也为未来筛选保护血管屏障功能的潜在治疗策略提供了强大的平台。尽管研究主要使用了HUVECs，未来采用器官特异性微血管内皮细胞并结合流体剪切应力，将能更真实地模拟体内环境，进一步揭示脓毒症中组织特异性的血管反应。这项研究深化了我们对生命体微环境中化学物理因素复杂互作的认识，向着最终攻克脓毒症这一临床难题迈出了坚实的一步。