溶瘤腺病毒YSCH-01通过激活I型干扰素信号通路在骨肉瘤PDX和CDX模型中展现显著治疗潜力

《Scientific Reports》：Therapeutic efficacy of oncolytic adenovirus YSCH-01 in osteosarcoma evaluated in PDX and CDX mouse models

本刊推荐：为突破骨肉瘤靶向治疗瓶颈，研究人员开展YSCH-01（重组L-IFN溶瘤腺病毒）治疗研究。通过PDX/CDX模型验证发现，该病毒能特异性感染CXADR+/Survivin+骨肉瘤细胞，诱导L-IFN表达并激活I型干扰素信号通路（ISG15/BST2/IFIT3等），产生显著局部及远端抗肿瘤效应。该研究为晚期骨肉瘤提供了新型免疫治疗策略。

　　

在儿童和青少年高发的原发性恶性骨肿瘤——骨肉瘤（Osteosarcoma, OS）治疗领域，医学界正面临严峻挑战。尽管化疗和手术技术不断进步，但近几十年来患者的生存率始终未能取得突破性提升，尤其是发生转移或复发的患者，其五年生存率仍徘徊在10%-30%的低水平。究其原因，骨肉瘤肿瘤基因组的高度复杂性导致了多样的分子畸变，使得寻找普适性治疗靶点变得异常困难。传统化疗的毒副作用和肿瘤的异质性更让治疗策略的制定如履薄冰。正是在这样的背景下，溶瘤病毒疗法（Oncolytic Virotherapy）作为一种新兴的癌症生物治疗方式，因其能够选择性在肿瘤细胞内复制并裂解细胞，同时激活机体抗肿瘤免疫反应，而展现出巨大的应用前景。

本研究聚焦于一种名为YSCH-01的重组溶瘤腺病毒，它是在OncoMul-V2病毒骨架的基础上，引入了经过基因工程改造的多功能治疗基因——L-IFN（一种新型重组I型干扰素）。YSCH-01采用了双重调控策略以确保其在肿瘤细胞内的靶向复制：其野生型E1A启动子被截短的Survivin（生存素）启动子所替代，同时E1A基因的CR2区域有24个碱基对的缺失。这种设计使其能够特异性地在Survivin高表达的肿瘤细胞中复制，从而最大限度地减少对正常细胞的影响。此前的研究已表明YSCH-01在恶性胶质母细胞瘤等实体瘤中具有良好的疗效，但其在骨肉瘤这一“硬骨头”中的具体作用及机制尚属未知。

为了回答YSCH-01能否成为对抗骨肉瘤的有力武器，研究人员开展了一系列严谨的临床前研究。他们首先从临床实际出发，分析了26例骨肉瘤患者肿瘤样本中与YSCH-01感染和作用相关的关键蛋白表达情况。免疫组化结果显示，超过80%的病例中腺病毒受体CXADR、Survivin以及免疫检查点蛋白PD-1呈阳性表达，这为YSCH-01靶向治疗提供了理论基础。随后，研究团队在体外（in vitro）和体内（in vivo）两个层面展开了深入探索。

研究采用的关键技术方法主要包括：利用免疫印迹（Western Blot）和免疫组化（IHC）分析蛋白表达；通过定量实时PCR（qPCR）检测基因转录水平；采用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）和结晶紫染色评估病毒体外细胞毒性；建立细胞系来源异种移植（CDX）和患者来源异种移植（PDX）小鼠模型进行体内药效学评价；通过流式细胞术（FACS）分析病毒感染效率；并利用RNA测序（RNA-seq）和基因本体论（GO）分析揭示差异表达基因和信号通路变化。临床样本来源于上海交通大学附属第六人民医院2022-2023年收治的骨肉瘤患者。

表达模式分析揭示YSCH-01治疗骨肉瘤的潜在靶点

研究人员在四种人骨肉瘤细胞系（143B, MNNG/HOS, MG-63, U-2 OS）和临床样本中分析了关键靶蛋白的表达。Western Blot结果显示，CXADR、Survivin、PD-1、RB1和IFNAR在骨肉瘤细胞中均有表达，而在正常人间充质基质细胞（hBMSC）中缺失。对26例临床样本的免疫组化分析进一步证实，CXADR、Survivin和PD-1在超过半数病例中呈现强阳性，阳性率分别为84.6%、76.9%和88.5%。这些蛋白的高表达为YSCH-01（其感染依赖于CXADR，复制由Survivin启动子驱动）靶向骨肉瘤细胞提供了分子基础。

YSCH-01在体外有效感染并溶解骨肉瘤细胞

通过携带绿色荧光蛋白（EGFP）的报告病毒OncoMul-V2-EGFP，研究人员证实了溶瘤腺病毒能够有效感染骨肉瘤细胞，且感染效率呈剂量依赖性，不同细胞系敏感性各异。在10 MOI（感染复数）的剂量下，感染率均超过90%。更重要的是，用YSCH-01感染细胞后，qPCR和Western Blot分析均检测到L-IFN在mRNA和蛋白水平上的显著表达，特别是在10 MOI剂量下。CCK-8细胞毒性实验和结晶紫染色清晰地显示，YSCH-01对骨肉瘤细胞具有剂量依赖性的杀伤作用，其半数抑制浓度（IC₅₀）在不同细胞系间存在差异（U-2 OS最为敏感，IC₅₀为18.49 MOI），提示个性化给药的重要性。

YSCH-01在CDX和PDX模型中展现强大抗肿瘤效应及远端疗效

体内实验是验证疗效的金标准。研究人员在裸鼠身上成功构建了基于U-2 OS、143B和MNNG/HOS细胞的CDX模型以及来自两位患者的PDX模型。瘤内注射YSCH-01（每2天一次，共5次）后，结果显示YSCH-01在注射部位对三种CDX模型肿瘤生长均产生了显著抑制，抑瘤率分别达到75.16%、107.45%和65.00%。尤为引人注目的是，在U-2 OS和143B模型中，YSCH-01对非注射侧（远端）的肿瘤也表现出抑制趋势，即产生了“远隔效应”（abscopal effect），而空载体病毒OncoMul-V2则无此效果。在PDX模型中，YSCH-01同样表现出强大的治疗效果，在注射部位和非注射部位均能显著抑制肿瘤生长，抑瘤率最高可达170.94%。所有治疗组小鼠体重未出现显著变化，表明YSCH-01具有良好的耐受性。

分子机制探究指向I型干扰素信号通路激活

为深入探究YSCH-01的作用机制，研究人员对YSCH-01治疗后的CDX模型肿瘤组织进行了RNA测序（RNA-seq）分析。基因表达谱差异分析显示，治疗组与对照组相比，有394个基因上调，644个基因下调。GO富集分析明确指出，最显著富集的通路是“ISG15-蛋白结合”和“对I型干扰素的反应”通路。qPCR验证进一步证实，I型干扰素刺激基因（ISGs），如ISG-15、BST2、IFITM1、IFIT3、OAS1和MX2等在YSCH-01治疗组肿瘤组织中的表达显著上调。这表明YSCH-01通过其携带的L-IFN基因，成功激活了肿瘤组织内的I型干扰素信号通路，这很可能是其发挥抗肿瘤作用，特别是引发免疫介导的远隔效应的关键机制。此外，体外实验发现，YSCH-01感染的骨肉瘤细胞上清液能够刺激小鼠外周血单核细胞（PBMC）分泌IFN-γ、IL-12a和TNF-α等促炎细胞因子，提示L-IFN可能通过激活免疫细胞间接贡献于抗肿瘤效果。

研究结论与展望

本研究通过系统的临床前评价，证实了重组溶瘤腺病毒YSCH-01在骨肉瘤治疗中的显著疗效和良好安全性。其作用机制是多方面的：一方面，病毒在Survivin和CXADR高表达的骨肉瘤细胞内特异性复制，直接溶解肿瘤细胞；另一方面，病毒表达的L-IFN被分泌到细胞外，激活肿瘤微环境及全身性的I型干扰素信号通路，招募和激活免疫细胞，从而产生局部和远端的抗肿瘤免疫反应。这种双重作用机制使其相较于空载体病毒展现出更优的疗效和独特的远隔效应优势。

当然，研究也留下了一些有待深入探索的问题，例如为何YSCH-01在不同骨肉瘤细胞系（如MNNG/HOS）中未能观察到一致的远隔效应，其背后的分子差异是什么？未来需要建立更多PDX模型以增强结论的普适性，并优化治疗策略（如与吉西他滨等化疗药物联用）以进一步提升疗效。此外，从YSCH-01正在进行的针对多种实体瘤的I/IIa期临床试验（CTR20241362）中观察到的外周血NK细胞数量增加的现象来看，深入剖析YSCH-01对骨肉瘤免疫微环境的重塑作用将是下一个研究重点。

综上所述，这项发表于《Scientific Reports》的研究不仅为晚期骨肉瘤患者带来了一种极具潜力的新型治疗选择——YSCH-01，更重要的是，它从分子层面揭示了I型干扰素信号通路在溶瘤病毒治疗骨肉瘤中的核心地位，为理解其作用机制和后续的生物标志物开发、联合治疗策略优化奠定了坚实的理论基础，有力地推动了溶瘤病毒疗法在骨肉瘤这一顽固堡垒中的临床转化进程。