碳水化合物底物对蜡样芽孢杆菌（太平洋芽孢杆菌）生长及肠毒素基因表达的影响：揭示乳糖的潜在保护作用

《Scientific Reports》：Effect of carbohydrate substrates on growth and enterotoxin gene expression in Bacillus cereus (pacificus)

本研究针对蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus s.l.）作为常见食源性致病菌，在不当储存食品和母乳中污染并引发胃肠疾病的问题，系统探究了不同温度及碳水化合物底物（葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、木糖醇）对B. cereus (pacificus) ATCC 10987菌株生长动力学及肠毒素基因（nhe, entFM, hbl, cytK）表达的影响。研究发现，乳糖环境不仅延缓细菌生长，还下调了非溶血性肠毒素（nhe）和肠毒素FM（entFM）基因的表达，而葡萄糖、果糖和蔗糖则促进快速生长。该成果为理解碳水化合物调控B. cereus致病潜能的分子机制提供了新见解，对婴幼儿配方食品及母乳储存的安全风险评估具有重要指导意义。

　　

在婴幼儿喂养和食品储存领域，蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus sensu lato, s.l.）的污染是一个不容忽视的公共卫生问题。这种革兰氏阳性、能形成芽孢的细菌广泛存在于土壤和植物中，极易污染多种食品，包括米饭、肉类、香料、蔬菜、乳制品，甚至储存不当的母乳。由其产生的肠毒素可引起恶心、呕吐和腹泻等胃肠道疾病，虽然对健康成年人通常症状轻微且自限，但对于免疫系统尚未发育成熟的婴儿或免疫功能低下的个体而言，感染风险显著增加，甚至可能导致致命后果。近年来，蜡样芽孢杆菌已成为食源性疾病暴发的主要原因之一。该菌对环境惊人的适应能力是其防控的主要挑战，其芽孢能耐受高温、酸碱等恶劣条件，使其能在多种食品加工和储存环境中存活。更复杂的是，其肠毒素的产生并非一成不变，而是受到环境因素的精密调控，尤其是营养物质的可用性。然而，关于不同碳水化合物如何影响蜡样芽孢杆菌的生长及其致病性肠毒素表达的系统性研究仍相对缺乏。鉴于碳水化合物是人类饮食和母乳（主要成分为乳糖）中的核心营养成分，深入探究其与蜡样芽孢杆菌致病潜能的关系，对于保障食品安全，特别是婴幼儿营养安全至关重要。为此，一项发表在《Scientific Reports》上的研究应运而生，旨在揭示不同碳水化合物底物对特定蜡样芽孢杆菌菌株生长和肠毒素基因表达的影响。

研究人员为开展此项研究，主要运用了几项关键技术：首先，通过全基因组测序（WGS）对实验菌株（Bacillus cereus ATCC 10987，近期被重新分类为Bacillus pacificus）进行了精确鉴定；其次，通过在不同温度下培养并监测光学密度（OD₆₀₀），系统评估了细菌在不同碳水化合物底物上的生长动力学，并应用修正的Gompertz模型进行拟合分析；接着，利用毛细管电泳（CE）技术定量分析了培养过程中碳水化合物消耗和有机酸（如甲酸、乙酸、乳酸）产生的变化；最后，核心部分采用了RNA-seq转录组测序技术，全面分析了在不同碳水化合物条件下培养后细菌的全局基因表达谱，并利用生物信息学工具（如DESeq2、KEGG通路富集分析）聚焦于肠毒素基因的表达差异。

3.1 菌株鉴定

研究首先对使用的蜡样芽孢杆菌菌株进行了全基因组测序鉴定，确认为Bacillus cereus ATCC 10987。值得注意的是，在论文准备过程中，该菌株因其独特的代谢特征（如产脲酶、利用木糖）已被重新分类为Bacillus pacificus。但考虑到科学界对该菌株的普遍认知和文献连续性，研究中仍沿用Bacillus cereus s.l. 的称谓。

3.2 不同温度和碳水化合物下的生长动力学

研究人员在15°C至37°C的温度范围内，测试了六种碳水化合物（果糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖、木糖醇）以及无添加碳水化合物的对照培养基对细菌生长的影响。结果表明，温度是影响生长速率的关键因素，37°C时生长最快。在37°C下，细菌在不同碳水化合物上的生长速率存在明显差异：蔗糖、葡萄糖和果糖支持最快速的生长（最大比生长速率μ_max分别为0.14 h^-1, 0.13 h^-1, 0.13 h^-1），而乳糖、半乳糖和木糖醇上的生长相对缓慢（μ_max分别为0.11 h^-1, 0.09 h^-1, 0.08 h^-1）。随着培养温度的降低，所有碳水化合物条件下的生长速率均下降，延迟期延长，倍增时间增加。

3.3 碳水化合物利用与代谢产物分析

在37°C培养12小时后，通过毛细管电泳分析了代谢产物的变化。结果显示，在葡萄糖、果糖和蔗糖培养基中，细菌表现出最高的代谢活性，乳酸、乙酸和甲酸等有机酸大量积累，导致培养液pH值显著下降（例如，葡萄糖组从初始pH 7.12降至5.37）。相应地，这些培养基中的碳水化合物消耗率也最高（葡萄糖消耗率达49.60%）。相反，在乳糖、半乳糖和木糖醇培养基中，有机酸产量较低，pH下降幅度较小，碳水化合物消耗率也低（例如，半乳糖消耗率仅为3.45%），表明细菌对这些底物的代谢效率较低。

3.4 转录组对碳水化合物源的全局响应

转录组分析揭示了细菌代谢对不同碳水化合物的高度可塑性。生长快速的底物（蔗糖、果糖）上调了三羧酸循环（TCA循环）、嘧啶代谢和碳固定等相关基因的表达。葡萄糖虽然也促进快速生长，但其表达谱显示糖酵解基因上调，而TCA循环和氧化磷酸化相关基因表达相对较低，提示存在碳分解代谢物抑制（CcpA介导）和溢出代谢（overflow metabolism）现象。生长缓慢的底物（木糖醇、半乳糖、乳糖）则上调了丙酸代谢、脂肪酸降解和赖氨酸降解等通路，这可能反映了细菌在利用非优选碳源时的代谢应激或适应性重组。

3.4.1 肠毒素基因的表达响应碳水化合物源

转录组分析检测了多种肠毒素基因的表达。结果发现，该菌株表达了非溶血性肠毒素（nheA, nheB, nheC）和肠毒素FM（entFM）的基因，但未检测到溶血素BL（hbl）和细胞毒素K（cytK）基因的表达。其他毒素基因如pre-toxin TG和LXG多态性毒素基因的表达量极低且不受底物影响。值得注意的是，nhe和entFM基因的表达受碳水化合物类型的显著调控。nheA, nheB, nheC基因在葡萄糖培养基中表达量最低，在乳糖培养基中也呈现下调趋势。而entFM基因的表达模式则不同，其在葡萄糖、果糖和蔗糖（快速生长条件）中表达较高，在乳糖、半乳糖和木糖醇（慢速生长条件）中表达最低。这表明nhe毒素的表达可能在最适生长条件下受到抑制，而entFM的表达则可能与细菌的代谢活跃度相关。

4. 讨论与结论

本研究系统阐明了温度和碳水化合物底物对蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus s.l.）生长和肠毒素基因表达的关键影响。研究证实，该菌株能在较宽温度范围内生长，但最适温度为37°C。在碳水化合物偏好方面，葡萄糖、果糖和蔗糖是高效能源，支持快速生长并伴随显著的有机酸积累和pH下降；而乳糖、半乳糖和木糖醇的利用效率较低，导致生长缓慢。

最重要的发现在于碳水化合物对肠毒素基因表达的调控作用。研究发现，支持最快速生长的葡萄糖环境，反而与nhe肠毒素基因的低表达相关。更引人注目的是，乳糖环境不仅减缓了细菌的生长速度，还下调了nhe和entFM这两种关键肠毒素基因的表达。这提示，母乳中富含的乳糖可能在一定程度上抑制了污染蜡样芽孢杆菌的致病潜能，从而对摄入母乳的婴儿起到某种保护作用。而entFM表达在快速生长条件下的上调，暗示其功能可能不同于经典肠毒素，或与细菌的基础代谢活动更密切相关。

该研究的发现具有重要的实际意义。它表明食品（尤其是婴幼儿配方食品）的碳水化合物组成不仅影响腐败菌的生长，还可能直接调节其毒素的产生，这为基于配方的食品安全风险评估和风险控制提供了新的科学依据。例如，在制定相关食品标准时，应考虑碳水化合物类型对潜在污染物致病性的影响。

当然，研究也存在一些局限性，如培养基中可能存在微量残余糖类，基因表达水平不等同于蛋白质活性等。未来的研究可结合蛋白质组学等技术进一步验证毒素的实际产量。

综上所述，这项研究深入揭示了碳水化合物代谢与蜡样芽孢杆菌致病性之间的复杂联系，特别是发现了乳糖在抑制肠毒素基因表达方面的潜在作用。这不仅增进了我们对这种重要食源性病原体生理学的理解，也为开发新的防控策略，尤其是在保障婴幼儿等脆弱人群的食品安全与营养健康方面，提供了有价值的科学线索。